NOX4-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成影響

[摘要] 目的 探討轉(zhuǎn)染NADPH氧化酶4（NOX4）小干擾RNA（siRNA）對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞（CFs）增殖和膠原合成的影響及其機(jī)制。

方法 分離乳鼠CFs，將CFs分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、AngⅡ組（加入10-6mol/L AngⅡ）、AngⅡ+siNOX4組（轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA后加入10-6mol/L AngⅡ）和AngⅡ+siNC組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA后加入10-6mol/L AngⅡ）。用免疫印跡法檢測(cè)各組NOX4、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、p-p38MAPK、p38MAPK的表達(dá)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。

結(jié)果 與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激后NOX4、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和p-p38MAPK蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活力均明顯升高（F=140.134～349.556，q=17.963～25.587，Plt;0.05）;轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA后AngⅡ刺激引起上述變化明顯減弱（q=15.839～36.742，Plt;0.05）。

結(jié)論

沉默NOX4可通過(guò)阻礙p38MAPK信號(hào)通路活化抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成。

[關(guān)鍵詞] 肌細(xì)胞，心臟;肌成纖維細(xì)胞;血管緊張素Ⅱ;NADPH氧化酶4;細(xì)胞增殖;膠原Ⅲ型

[中圖分類號(hào)] R329.411;R345.4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）05-0742-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.170

[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211029.1735.007.html;2021-11-01 16：47：01

EFFECT OF NOX4-SIRNA TRANSFECTION ON CARDIAC FIBROBLAST PROLIFERATION AND COLLAGEN SYNTHESIS INDUCED BY ANG Ⅱ

HE Zhaohui， WANG Zhiqian， WANG Guoliang， ZHENG Xianjie， TENG Wei

（Department of Car-

diology， First Affiliated Hospital of Henan University， Kaifeng 475000， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of transfection with NADPH oxidase 4 （NOX4） small interfering RNA （siRNA） on the proliferation of cardiac fibroblasts （CFs） and collagen synthesis induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ） and its mechanism.

Methods CFs were isolated from neonatal mice and divided into control group （normal culture）， Ang Ⅱ group （adding 10-6 mol/L Ang Ⅱ）， Ang Ⅱ+siNox4 group （adding 10-6 mol/L Ang Ⅱ after transfection with NOX4 siRNA）， and Ang Ⅱ+siNC group （adding 10-6 mol/L Ang Ⅱ after transfection with NC siRNA）. Western blot was used to determine the expression of NOX4， collagen Ⅰ， collagen Ⅲ， phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase （p-p38MAPK）， and p38 mitogen-activated protein kinase （p38MAPK）. Cell Counting Kit-8 assay was used to determine the cell proliferation.

Results Compared with the control group，

the Ang Ⅱ group had significantly increased expression levels of NOX4， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ，

and p-p38MAPK proteins and cell proliferation activity （F=140.134-349.556，q=17.963-25.587，Plt;0.05）; the changes induced by Ang Ⅱ were significantly decreased after transfection with NOX4 siRNA （q=15.839-36.742，Plt;0.05）.

Conclusion Silencing NOX4 can inhibit the proliferation of CFs and collagen synthesis induced by Ang Ⅱ by blocking activation of the p38MAPK signaling pathway.

[KEY WORDS] myocytes， cardiac; myofibroblasts; angiotensin Ⅱ; NADPH oxidase 4; cell proliferation; collagen type Ⅲ

心肌纖維化是心血管疾病終末期共同的生理病理過(guò)程[1]。心肌成纖維細(xì)胞（CFs）異常增殖和膠原蛋白合成增多是心肌纖維化的重要表現(xiàn)，研究影響CFs增殖和膠原蛋白合成的分子機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)對(duì)心血管疾病的治療具有重要意義。還原型煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶非吞噬細(xì)胞氧化酶4（NOX4）是NADPH NOX家族成員，在成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等中廣泛表達(dá)，與肺、腎、肝和心臟等多種組織纖維化過(guò)程密切相關(guān)[2-3]。本研究通過(guò)觀察轉(zhuǎn)染NOX4小干擾RNA（siRNA）對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原蛋白的影響，揭示NOX4在心肌纖維化過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

出生2 d雄性清潔級(jí)SD乳鼠（河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。AngⅡ（美國(guó)Sigma），胎牛血清和胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone），青霉素-鏈霉素（青鏈霉）雙抗和DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibico公司），轉(zhuǎn)染試劑LipofectineTM2000（美國(guó)Invitrogen公司），RIPA裂解液和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），ECL化學(xué)發(fā)光劑和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（索萊寶生物公司），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ抗體（武漢博士德生物公司），GAPDH、p38MAPK、p-p38MAPK和NOX4抗體（美國(guó)CST公司），HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（天津三箭生物公司）。CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀和凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CFs分離與培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取SD乳鼠的心肌組織并剪碎后，加入1.25 g/L胰蛋白酶消化，收集上清液，加入含體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉雙抗和體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)CFs比心肌細(xì)胞貼壁速度快的特點(diǎn)采用差速貼壁法貼壁培養(yǎng)2 h。除去未貼壁的細(xì)胞，獲得的貼壁的細(xì)胞多數(shù)為CFs，并采用波形蛋白免疫熒光法鑒定為CFs（純度達(dá)98%）。培養(yǎng)達(dá)80%融合度時(shí)，胰蛋白酶消化并按1∶2傳代，收集第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)分為如下4組。①對(duì)照組（A組）：正常培養(yǎng);②AngⅡ組（B組）：加10-6mol/L AngⅡ刺激48 h;③AngⅡ+siNC組（C組）：陰性對(duì)照NC-siRNA轉(zhuǎn)染CFs后加10-6mol/L AngⅡ刺激48 h;④AngⅡ+siNOX4組（D組）：采用NOX4干擾序列NOX4-siRNA轉(zhuǎn)染CFs后，加入10-6mol/L AngⅡ刺激48 h。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CFs以每孔106個(gè)接種至6孔細(xì)胞板上，置于37 ℃、含有體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至達(dá)70%融合時(shí)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。其中，NOX4-siRNA和NC-siRNA由上海吉瑪公司合成。NOX4-siRNA和NC-siRNA的RNA序列見(jiàn)表1。參照轉(zhuǎn)染試劑LipofectineTM2000說(shuō)明書(shū)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將NC-siRNA和NOX4-siRNA轉(zhuǎn)染至CFs中。轉(zhuǎn)染5 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 NOX4蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫印跡法檢測(cè)。收集AngⅡ刺激48 h的AngⅡ組、AngⅡ+siNC組、AngⅡ+siNOX4組和正常培養(yǎng)的對(duì)照組CFs，加入RIPA裂解液抽提各組細(xì)胞總蛋白后，參照BCA蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)總蛋白的濃度。

將熱變性處理后的蛋白樣品以每孔70 μg上樣至SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，待分離結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。使用50 g/L脫脂奶粉封閉處理2 h后，NOX4抗體（1∶500）、GAPDH抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。次日，再以HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體（1∶2 000）室溫孵育2 h。以ECL在暗室內(nèi)顯影后，將GAPDH作為內(nèi)參照，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)。將AngⅡ處理結(jié)束后的CFs和正常培養(yǎng)的對(duì)照組CFs以每孔104個(gè)接種至96孔細(xì)胞板，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后，參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的光密度值。光密度值越大代表細(xì)胞增殖越活躍。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、p-p38MAPK和p38MAPK蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫印跡法檢測(cè)。詳細(xì)步驟可參照1.2.3。其中，在脫脂奶粉封閉后，分別采用Collagen Ⅰ抗體（1∶1 000）、Collagen Ⅲ抗體（1∶1 000）、p-p38MAPK抗體（1∶800）和p38MAPK抗體（1∶800）孵育。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s形式表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA對(duì)CFs中NOX4蛋白表達(dá)的影響 免疫印跡法檢測(cè)的結(jié)果表明，對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+siNC組和AngⅡ+siNOX4組細(xì)胞中NOX4蛋白的表達(dá)水平分別為0.35±0.03、0.57±0.04、0.62±0.05和0.12±0.02，各組間NOX4蛋白的表達(dá)水平之間存在明顯差異（F=349.556，P<0.001）。見(jiàn)圖1。兩兩比較結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AngⅡ組細(xì)胞中NOX4蛋白表達(dá)水平明顯升高（q=17.963，Plt;0.05）;與AngⅡ組比較，AngⅡ+siNC組NOX4蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變（Pgt;0.05），但AngⅡ+siNOX4組NOX4蛋白表達(dá)水平明顯降低（q=36.742，Plt;0.05）。

2.2 轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA對(duì)CFs增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+siNC組和AngⅡ+siNOX4組細(xì)胞增殖活力存在明顯差異（F=140.134，P<0.001）。兩兩比較結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激明顯促進(jìn)了CFs增殖活力（q=25.587，Plt;0.05）;與AngⅡ組相比，NOX4-siRNA轉(zhuǎn)染后CFs增殖活力明顯降低（q=15.839，Plt;0.05），而轉(zhuǎn)染NC-siNRA對(duì)CFs增殖活力無(wú)明顯影響（Pgt;0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA對(duì)CFs膠原蛋白合成影響

免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中膠原蛋白CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表達(dá)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激可引起CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)水平升高（F=142.742、404.800，Plt;0.001）。與AngⅡ組相比，轉(zhuǎn)染NC-siNRA后CFs中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化（Pgt;0.05），但轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA可使CFs中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)水平明顯降低（q=17.242、27.727，Plt;0.05）。見(jiàn)圖3和表2。

2.4 轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA對(duì)CFs中p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-p38MAPK和p38MAPK的表達(dá)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中p38MAPK蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，但AngⅡ刺激后CFs中p-p38MAPK蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高（F=182.909，P<0.001）;轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA組p-p38MAPK蛋白的表達(dá)水平明顯降低（q=18.434，Plt;0.05），而轉(zhuǎn)染NC-siRNA組p-p38MAPK蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化（Pgt;0.05）。見(jiàn)圖4和表3。

3 討" 論

AngⅡ是經(jīng)典的腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要活性成分，可刺激CFs增生和膠原蛋白的分泌等，在心肌的纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，常被用來(lái)作為體外研究心肌纖維化的誘導(dǎo)因子[4-5]。本研究參照文獻(xiàn)的方法[6]選用濃度為10-6mol/L AngⅡ刺激體外培養(yǎng)的CFs構(gòu)建心肌纖維化細(xì)胞模型。結(jié)果顯示，AngⅡ刺激后CFs增殖活力和膠原蛋白CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平均明顯升高。這表明本研究中10-6mol/L AngⅡ可誘導(dǎo)CFs增殖和膠原蛋白合成，心肌纖維化細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

NOX4是一種與肝組織發(fā)生纖維化密切相關(guān)的NADPH氧化酶，可以通過(guò)ROS信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用;抑制NOX4信號(hào)通路可以減弱結(jié)核性胸膜纖維化[7-8]。NOX4在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，siRNA抑制NOX4表達(dá)可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞增殖[9]。此外，NOX4抑制劑可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞膠原蛋白CollagenⅠ的表達(dá);靶向干擾NOX4可抑制TGF-β1誘導(dǎo)CFs膠原合成[10-11]。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ可誘導(dǎo)CFs中NOX4蛋白表達(dá)上調(diào)。這提示NOX4在AngⅡ誘導(dǎo)的CFs纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA后AngⅡ誘導(dǎo)CFs增殖和膠原蛋白CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的表達(dá)明顯受到抑制。這提示，NOX4在AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。

p38MAPK信號(hào)通路是MAPK通路的重要分支，可通過(guò)磷酸化作用影響相關(guān)基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。研究顯示，在AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成過(guò)程中p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[13-14]。已有研究指出，沉默NOX4表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路活化[15]。為了探討NOX4調(diào)控CFs增殖和膠原合成的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA后AngⅡ誘導(dǎo)p38MAPK磷酸化水平明顯降低，p38MAPK信號(hào)通路的活化明顯受到抑制。結(jié)果表明，在AngⅡ誘導(dǎo)的CFs中NOX4可調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路。這提示NOX4介導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成可能與p38MAPK信號(hào)通路的活化有關(guān)。

綜上所述，NOX4-siRNA轉(zhuǎn)染可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成，其作用機(jī)制可能與抑制p38MAPK信號(hào)通路活化有關(guān)。該研究結(jié)果進(jìn)一步闡述了心肌成纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，也為以NOX4為靶點(diǎn)預(yù)防和改善心肌纖維化提供了新的參考依據(jù)。然而，本研究未涉及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究NOX4對(duì)心肌成纖維化的影響尚顯不足，后續(xù)研究將通過(guò)動(dòng)物模型對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)充和探究。

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（本文編輯 于國(guó)藝）