HOTAIR與miR-613表達對食管鱗癌細胞增殖和凋亡影響

[摘要] 目的 探討HOX轉錄反義RNA（HOTAIR）和微小RNA（miR）-613在食管鱗癌細胞中的調控關系及其對細胞增殖與細胞凋亡的影響。

方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測食管鱗癌細胞中HOTAIR和miR-613的表達情況，雙熒光素酶報告基因實驗檢測HOTAIR和miR-613靶向關系，CCK-8法和流式細胞儀檢測細胞增殖和凋亡。

結果 與其他食管鱗癌細胞相比，人食管鱗癌細胞株Eca-109細胞中HOTAIR表達最高而且miR-613表達水平最低（F=48.56、56.28，Plt;0.05）。HOTAIR可靶向調控miR-613的表達。下調HOTAIR的表達明顯抑制了Eca-109細胞增殖，提高了細胞凋亡和miR-613表達水平（F=205.28～396.53，Plt;0.05）;抑制miR-613表達后，Eca-109細胞增殖能力明顯增強，而細胞凋亡能力明顯減弱（F=51.04、511.37，Plt;0.05）。

結論 下調HOTAIR可通過調控miR-613表達抑制食管鱗癌Eca-109細胞增殖并促進其凋亡。

[關鍵詞] 食管鱗狀細胞癌;HOX轉錄反義RNA;RNA，長鏈非編碼;微RNAs;細胞增殖;細胞凋亡

[中圖分類號] R735.1;R342.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0736-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.171

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20211029.1732.002.html;2021-11-02 13：27：02

EFFECT OF THE EXPRESSION OF HOX TRANSCRIPT ANTISENSE INTERGENIC RNA AND MICRORNA-613 ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA CELLS

CHEN Zhijun， CAO Ke-

xin， ZHU Deqi， GAN Shaoyin， WANG Zhongmin

（Department" of Thoracic Surgery， The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， Xinxiang" 453100， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the regulatory role of HOX transcript antisense intergenic RNA （HOTAIR） and microRNA-613 （miR-613） in esophageal squamous cell carcinoma cells and their effect on cell proliferation and apoptosis.

Me-

thods Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of HOTAIR and miR-613 in esophageal squamous cell carcinoma cells; dual luciferase reporter gene assay was used to detect the targeting relationship between HOTAIR and miR-613; CCK-8 assay and flow cytometry were used to measure cell proliferation and apoptosis.

Results Compared with other esophageal squamous cell carcinoma cell lines， the human esophageal squamous cell carcinoma cell line Eca-109 had the highest expression level of HOTAIR and the lowest expression level of miR-613 （F=48.56，56.28;Plt;0.05）. HOTAIR showed targeted regulation of miR-613 expression. Downregulation of HOTAIR expression significantly inhibited the proliferation of Eca-109 cells and increased cell apoptosis and the expression level of miR-613 （F=205.28-396.53，Plt;0.05）. After the expression of miR-613 was inhibited， Eca-109 cells showed a significant increase in proliferation and a significant reduction in apoptosis （F=51.04，511.37;Plt;0.05）.

Conclusion Downregulation of HOTAIR can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of Eca-109 cells by regulating the expression of miR-613.

[KEY WORDS] esophageal squamous cell carcinoma; HOX transcript antisense intergenic RNA; RNA， long noncoding; microRNAs; cell proliferation; apoptosis

食管癌是一種發病率和病死率均很高的消化道惡性腫瘤，其中腺癌和鱗狀細胞癌是常見的病理類型，而我國以食管鱗狀細胞癌最為常見。過去十幾年來，全球食管癌的發病率急劇升高[1]，而預計未來幾十年，其發病率還將持續升高，嚴重威脅著人類身體健康[2]。盡管手術切除、新輔助放化療等使食管癌病人的療效有所改善，但病人5年內的總生存率仍然較低[1，3]。因此，為了更好地治療食管癌而深入研究其發病機制是十分必要的。HOX轉錄反義RNA（HOTAIR）是一種具有反式轉錄調控作用的長鏈非編碼RNA（lncRNA），定位于hoxc基因座，全長2 158 nt，在多種實體瘤中異常高表達，通過與微小RNA（miRNA）的相互作用，參與腫瘤的發生發展[4]。HOTAIR在多種腫瘤中異常高表達并發揮著重要的促癌作用[5]，在食管鱗癌中HOTAIR參與了腫瘤細胞增殖、侵襲和凋亡等的調控[6]，但其在食管鱗癌中的作用機制尚不完全明確。miR-613是一類與腫瘤發生和發展密切相關的短鏈非編碼RNA（NcRNA），被證實在喉鱗癌和胃癌等腫瘤中異常表達，并在癌細胞增殖、侵襲和遷移等生物學過程中發揮著重要作用[7-8]。miR-613在食管鱗癌組織和血清中異常低表達，與病人腫瘤分期和預后不良密切相關[9]，但其在食管鱗癌中的作用并不清楚。本研究通過體外細胞實驗觀察HOTAIR和miR-613在食管鱗癌細胞中的表達，并進一步探討了二者的相互作用關系及其在食管鱗癌細胞增殖和凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

青鏈霉素雙抗和RPMI 1640培養基（加拿大Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），RNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測試劑盒（大連寶生物工程），miR-613 模擬物（mimics）、miR-613抑制劑（inhibitor）及模擬物對照（mimics-NC）、抑制劑對照（inhibitor-NC）和HOTAIR干擾序列si-HOTAIR（5′-CAUAUUA-

UAGAGUUGCUCUGUGCUG-3′）及其陰性對照si-NC（5′-GAGUAUGUGAGAUUAACUGGUGG-

C-3′）（上海吉瑪公司），Trizol試劑和轉染試劑脂質體3000（美國Invitrogen公司），膜聯蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（大連美侖生物公司），細胞計數（CCK-8法）試劑盒（上海碧云天生物公司），雙熒光素酶活性檢測試劑盒（上海澤葉生物公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞來源及其培養 人食管鱗癌細胞株Eca-109和EC9706購于中國科學院上海生物研究所細胞庫，而人食管鱗癌細胞株KYSE450購自上海雅吉生物公司。使用含體積分數0.10胎牛血清和RPMI 1640的培養基，在含體積分數0.05 CO2、37 ℃和濕度飽和的細胞培養箱中常規培養Eca-109、EC9706和KYSE450細胞株，每2 d換液1次。待細胞貼壁80%～90%時，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，并以1∶2比例傳代。選取長勢良好的第3代指數期細胞進行實驗。

1.2.2 RT-qPCR方法檢測HOTAIR和miR-613的表達 向待測的食管鱗癌細胞株中加入Trizol試劑提取細胞總RNA后，使用紫外線分光光度計檢測總RNA的濃度與純度。根據RNA反轉錄試劑盒說明書將RNA進行反轉錄后，以反轉錄產物為模板，根據上海吉瑪公司合成的PCR引物，參照RT-qPCR檢測試劑盒說明書進行PCR擴增，分別以GAPDH和U6為內參照，采用2-△△Ct法評價細胞中HOTAIR和miR-613表達水平。所用PCR引物及其序列見表1。實驗重復3次。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因實驗 本文為了驗證HOTAIR是否能與miR-613相結合，將HOTAIR基因的3′UTR克隆并重組至熒光素酶報告基因載體psiCHECK-2上，并以其作為HOTAIR的野生型（HOTAIR-WT），另將miR-613與HOTAIR基因的3′UTR結合位點進行定點突變后克隆并重組至psiCHECK-2上，并以其作為HOTAIR突變型（HOTAIR-MUT）。按轉染試劑脂質體3000說明書，將以250 μL無血清培養基稀釋的HOTAIR-WT/MUT質粒（4.0 μg）、miR-613 mimics/mimics-NC（含量為100 pmol）與250 μL無血清培養基稀釋的脂質體3000（10 μL）混勻后加入293T細胞，其中每個處理設3個重復。轉染48 h后收集各組細胞，并參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測各組細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.2.4 細胞轉染 ①HOTAIR基因影響Eca-109細胞增殖凋亡和miR-613表達的實驗：分為對照組（a組，未轉染）、si-NC組（b組，轉染si-NC）和si-HOTAIR組（c組，轉染si-HOTAIR），每組設3個重復。②miR-613影響Eca-109細胞增殖凋亡實驗：分為si-HOTAIR組（a組，轉染si-HOTAIR）、si-HOTAIR+inhibitor-NC組（b組，共轉染si-HOTAIR和inhibitor-NC）和si-HOTAIR+miR-613 inhibitor組（c組，共轉染si-HOTAIR和miR-613 inhibitor），每組設3個重復。將指數期Eca-109細胞以每孔4×105個接種至6孔細胞板上，置于細胞培養箱內常規培養。待細胞達70%～80%融合度時，根據實驗分組參照轉染試劑脂質體3000說明書步驟，將以250 μL無血清培養基稀釋的si-NC、si-HOTAIR、inhibitor-NC和miR-613 inhibitor（母液為20 μmol/L，1.56 μL）分別與250 μL無血清培養基稀釋的脂質體3000（10 μL）混合，混勻后加入到Eca-109細胞中。轉染5 h后更換新鮮培養基，繼續培養48 h后，收集各組細胞并采用RT-qPCR檢測細胞中HOTAIR和miR-613的表達水平以評價轉染效果。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉染48 h后的si-NC組、si-HOTAIR組和未轉染的對照組以每孔105個接種至96孔細胞板上后，置于細胞培養箱中常規培養。待培養至所需時間12、24、48和72 h后，棄培養液并參照CCK-8試劑盒說明書分別檢測各組細胞的光密度（OD）值。另外，轉染48 h后si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor-NC組和si-HOTAIR+miR-613 inhibitor組細胞的增殖活力檢測方法同上。實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集轉染48 h后的si-NC組、si-HOTAIR組和未轉染的對照組細胞，分別以磷酸緩沖液洗滌3次后，參照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書檢測各組細胞凋亡率。同時，采用相同方法檢測轉染48 h后si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor-NC組和si-HOTAIR+miR-613 inhibitor組細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料數據以±s表示，3組間均數的比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法，兩組間均數的比較采用獨立樣本t檢驗，3組間細胞增殖均數隨時間變化采用析因設計的方差分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 HOTAIR和miR-613在食管鱗癌細胞株中的表達

采用RT-qPCR檢測3種食管鱗癌細胞株Eca-109、KYSE-450和EC9706中HOTAIR的相對表達水平。單因素方差分析結果顯示，3種細胞株HOTAIR的相對表達水平差異有統計學意義（F=56.28，Plt;0.05）;多重比較結果顯示，與KYSE-450細胞和EC9706細胞相比，HOTAIR在Eca-109細胞中的表達水平相對較高（P均lt;0.05）。單因素方差分析結果顯示，3種細胞株miR-613的相對表達水平差異有統計學意義（F=48.56，Plt;0.05）;多重比較結果顯示，miR-613在Eca-109細胞中的表達水平均明顯低于KYSE-450細胞和EC9706細胞（P均lt;0.05）。見圖1A、B。故選用Eca-109細胞株進行后續實驗。

2.2 HOTAIR和miR-613靶向關系的驗證

采用PicTar、miRanda、TargetScan和Microcosm Targets生物信息學軟件預測顯示，HOTAIR和miR-613存在互補的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗的檢測結果顯示，與mimics-NC相比，miR-613 mimics可使轉染HOTAIR-WT質粒細胞的熒光素酶活性降低（t=33.09，Plt;0.05），但對轉染HOTAIR-MUT質粒細胞的熒光素酶活性無明顯影響（Pgt;0.05）。見圖2A、B。

2.3 HOTAIR對食管鱗癌Eca-109細胞增殖凋亡和miR-613表達的影響

本文RT-qPCR的檢測結果顯示，在3組細胞中HOTAIR和miR-613表達整體比較有顯著差異（F=346.54、396.53，Plt;0.05），轉染si-HOTAIR后細胞中HOTAIR表達水平明顯低于對照組（Plt;0.05），而miR-613的表達水平則明顯高于對照組（Plt;0.05），但轉染si-NC對HOTAIR和miR-613的表達無明顯影響（Pgt;0.05）。見圖3A、E。CCK-8法檢測結果的析因設計方差分析顯示，F組別=26.58、Plt;0.05，F時間=40.62、Plt;0.05，F組別×時間=12.85、Plt;0.05;單獨效應結果顯示，作用12 h和24 h時間下，3組細胞的OD值差異無顯著性（Pgt;0.05）;作用48 h和72 h時間下，3組細胞的OD值存在顯著差異（F=94.92、35.48，Plt;0.05）;轉染si-HOTAIR 48、72 h后Eca-109細胞增殖活力較對照組明顯受到抑制（Plt;0.05），但轉染si-NC對Eca-109細胞增殖無明顯影響（Pgt;0.05）。見圖3B。同時，流式細胞儀檢測結果顯示，3組細胞凋亡率之間存在著明顯差異（F=205.28，Plt;0.05）。與對照組相比，轉染si-NC后Eca-109細胞凋亡率無明顯變化（Pgt;0.05），但轉染si-HOTAIR 可使Eca-109細胞凋亡率明顯升高（Plt;0.05）。見圖3C、D。

2.4 miR-613對食管鱗癌Eca-109細胞增殖和凋亡的影響

本文RT-qPCR檢測結果顯示，miR-613在si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor-NC組和si-HOTAIR+miR-613 inhibitor組細胞中的表達存在顯著差異（F=511.37，Plt;0.05）;轉染miR-613 inhibitor后Eca-109細胞中miR-613表達水平較si-HOTAIR組降低（Plt;0.05），而轉染inhibitor-NC后細胞中的miR-613表達與對照組比較則無明顯變化（Pgt;0.05）。見圖4A。CCK-8法檢測結果的析因設計方差分析顯示，F組別=29.22、Plt;0.05，F時間=48.87、Plt;0.05，F組別×時間=16.74、Plt;0.05;單獨效應結果顯示，轉染12 h和24 h后3組細胞的OD值無明顯差異（Pgt;0.05）;作用48 h和72 h時間下，3組細胞的OD值存在顯著差異（F=66.74、59.64，Plt;0.05）;與si-HOTAIR組相比較，轉染miR-613 inhibitor 48 h后Eca-109細胞增殖活力明顯升高（Plt;0.05），而轉染inhibitor-NC對Eca-109細胞增殖活力無明顯影響（Pgt;0.05）。見圖4B。另外，3組細胞凋亡率有顯著性差異（F=51.04，Plt;0.05）;轉染miR-613 inhibitor后Eca-109細胞凋亡率較si-HOTAIR組明顯降低（Plt;0.05），而轉染inhibitor-NC后其細胞凋亡率與si-HOTAIR組比較無顯著差異（Pgt;0.05）。見圖4C、D。

3 討" 論

食管癌的發病機制十分復雜，與多種致癌基因和抑癌基因的異常改變和調控失調密切相關[10-11]。而人類大約有98%的DNA會轉錄成lncRNA和NcRNA[12]，其中lncRNA是一類長度超過200 nt的RNA，可通過與腫瘤相關的miRNA相互作用，參與腫瘤的發生與發展;而miRNA是一類長度約為22 nt的NcRNA，可以通過調控相關靶基因的表達，在細胞增殖、凋亡中發揮著重要作用;部分異常表達的lncRNA或miRNA在腫瘤中發揮著癌基因或抑癌基因的作用[13-14]。因此，深入研究lncRNA和miRNA在食管癌中的作用十分必要。

HOTAIR是首個被發現的有反式調控作用的lncRNA，可通過與甲基化酶復合體RPC2共同作用，調控與腫瘤相關的PTEN和p21等基因的表達，在腫瘤細胞增殖和凋亡等過程中發揮著重要作用，被作為惡性腫瘤早期診斷、預后預測和基因治療的分子標記物和潛在治療靶點[5]。HOTAIR在乳癌、宮頸癌和結直腸癌等腫瘤中異常高表達，可以通過調控miR-20a-5p、miR-143-3p和miR-203a-3p等的表達影響細胞增殖和凋亡等促進腫瘤的發生發展[15-17]。本研究通過轉染HOTAIR干擾序列成功下調食管鱗癌細胞株Eca-109細胞中HOTAIR表達，結果顯示，Eca-109細胞增殖能力明顯減弱且細胞凋亡能力明顯增強。這與崔廣暉等[6]報道的干擾HOTAIR可抑制食管鱗癌EC9706細胞增殖并促進其凋亡的結果相吻合。該結果在另一種食管鱗癌Eca-109細胞中證實了HOTAIR的促癌作用。

miR-613在不同腫瘤組織中存在異常表達，且發揮的作用不盡相同。在宮頸癌中miR-613表達較鄰近正常組織高表達，而上調其表達可通過靶向調控酪氨酸蛋白磷酸酶非受體型9促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[18]。在骨肉瘤中miR-613表達下調，miR-613表達升高可通過直接抑制趨化因子受體4表達抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和誘導凋亡[19]。miR-613被證實在食管鱗癌中異常低表達，被認為是食管鱗癌病人總生存率和無進展生存率獨立預后因子[9]。有研究證實，HOTAIR可通過競

爭性吸附miR-613調控胰腺癌細胞增殖、細胞周期和凋亡等發揮促癌作用[20]。本研究先在生物信息學軟件中預測到HOTAIR和miR-613存在著互補的結合位點，兩者之間可能在食管鱗癌細胞中存在著相互作用關系;通過雙熒光素酶報告基因實驗檢測證實miR-613可與HOTAIR 3′UTR靶向結合;同時，RT-qPCR檢測證實下調HOTAIR表達可引起食管鱗癌Eca-109細胞中miR-613表達升高;另外，轉染miR-613 inhibitor成功下調miR-613表達后明顯促進了Eca-109細胞增殖并抑制其凋亡。本文研究結果表明，在食管鱗癌中HOTAIR可靶向調控miR-613表達，低表達的miR-613可通過調控細胞增殖和凋亡促進食管癌的發生發展。

綜上所述，HOTAIR可通過靶向調控miR-613在食管鱗癌Eca-109細胞增殖和凋亡過程中發揮著重要作用，該結果進一步豐富了HOTAIR促進食管鱗癌惡性發展的分子機制，為HOTAIR有望成為靶向治療食管鱗癌的后續靶基因提供了新的參考依據。

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（本文編輯 于國藝）