ZNRF3在類風濕關節炎滑膜組織與細胞表達及意義

[摘要] 目的 分析鋅指環指蛋白3（ZNRF3）在類風濕關節炎（RA）滑膜組織和細胞中表達及其與疾病發生的關系。

方法 選擇2018年3月—2020年3月我院收治的一側RA膝關節病變病人20例，根據病人病灶位置分為觀察組（RA側）與對照組（C側），收集兩組滑膜組織、成纖維樣滑膜細胞（FLS）并鑒定滑膜細胞，分別采用實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）和Western blot方法檢測兩組滑膜組織和FLS中ZNRF3的mRNA和蛋白表達。

結果

RA病人觀察組的免疫組化評分、滑膜組織中ZNRF3的mRNA和蛋白表達均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（t=8.963～105.292，Plt;0.05）;RA側FLS中ZNRF3的mRNA和蛋白表達明顯高于C側FLS，差異均有統計學意義（t=43.330、62.721，Plt;0.05）。

結論 RA病人病變側滑膜組織和FLS中的ZNRF3表達量明顯升高，可能與Wnt信號通路過度激活誘導ZNRF3生成增加，以及負反饋調節Wnt通路活性有關。

[關鍵詞] 關節炎，類風濕;鋅指環指蛋白3;滑膜;滑膜細胞;Wnt信號通路

[中圖分類號] R593.22

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0697-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.175

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211029.1732.004.html;2021-11-01 15：55：01

ZINC AND RING FINGER 3 EXPRESSION IN SYNOVIAL TISSUES AND CELLS OF RHEUMATOID ARTHRITIS AND ITS RELATIONSHIP WITH DISEASE OCCURRENCE

XU Jing， LIANG Yi， YANG Maoyi， LI Qiang

（Department of Rheumatology and Osteoarthritis， Sichuan Orthopedic Hospital， Chengdu 610041， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate zinc and ring finger 3 expression in synovial tissues and cells of rheumatoid arthritis （RA） and its relationship with disease occurrence.

Methods A total of 20 RA patients with unilateral knee joint disease in our hospital from March 2018 to March 2020 were selected， and classified into lesion side （Lesion） and control side （C）. The synovial tissues and fiber-like synovial cells （FLS） were collected， and synovial cells were identified. Then the expression of ZNRF3 in synovial tissues and FLS was analyzed.

Results The expression of synovial ZNRF3 in the immunohistochemical， qPCR and WB results of Lesion" group was significantly higher than that of C group （t=8.963-105.292，Plt;0.05）. The expression of ZNRF3 of Lesion-FLS in qPCR and WB results was significantly higher than that of C-FLS （t=43.330，62.721;Plt;0.05）.

Conclusion The high expression of ZNRF3 in synovial tissues and FLS of the affected side of RA patients is speculated to be related to the increased production of ZNRF3 caused by over-activation of Wnt signaling pathway， which can be improved through the negative feedback regulation of Wnt pathway activity.

[KEY WORDS] arthritis， rheumatoid; zinc and ring finger 3; synovial membrane; synoviocytes; Wnt signaling pathway

類風濕關節炎（RA）是人體關節滑膜病變出現的慢性炎癥反應，導致病人出現不同程度關節破壞的疾病[1-2]。目前我國RA患病率為0.42%，病程越長病人致殘率越高，其中病程超過15年者致殘率可高達61.3%[3-4]。既往資料顯示，成纖維樣滑膜細胞（FLS）在RA病人中呈病態上升，而其凋亡下降，形成血管翳侵蝕軟骨，最終導致關節功能障礙甚至喪失，嚴重影響病人身心健康及生活質量[5-6]。在RA中，激活FLS由多信號通路決定，而Wnt信號通路具有重要性，被認為參與了RA發生發展[6-7]。鋅指環指蛋白3（ZNRF3）是一種Wnt通路調控蛋白，可經泛素化降解細胞膜表面Wnt蛋白受體卷曲蛋白，從而對Wnt信號通路活性產生抑制作用[8-9]。目前關于ZNRF3的研究主要集中于腫瘤細胞中，對RA研究較少。本研究探討ZNRF3在RA病人滑膜組織及細胞中表達，并分析其與疾病發生的關系。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 對象選擇 2018年3月—2020年3月，選擇我院收治一側RA膝關節病變病人20例，男6例，女14例，年齡（44.32±9.65）歲。紅細胞沉降率為（39.84±16.56）mm/1 h，C反應蛋白為（20.42±12.65）mg/L。根據病人病灶組織位置分為觀察組（病變側，RA側）與對照組（正常側，C側）。納入標準：①符合《2018中國類風濕關節炎診療指南》中相關診斷標準[10];②臨床資料完整;③正常組織側滑膜組織及檢測部位無外傷，無其他炎癥性疾病或一側關節慢性疾病。排除標準：①其他肌肉骨骼疾病者;②合并重要臟器疾病者。本研究通過我院醫學倫理委員會批準，所有病人及家屬均知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 包括免疫組化、實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）、Western blot方法的主要試劑與儀器。儀器：Rigel S2流式細胞儀（上海睿鈺生物科技有限公司），微量分光光度儀（美國哈希，DR 6000型），光學顯微鏡（奧林巴斯，CX43型），PCR儀（美國羅氏，LC480型）。試劑：Anti-ZNRF3一抗（上海瑞齊生物技術有限公司），ZNRF3二抗（微蒙上海生物科技有限公司），CD29、CD90抗體（英國BioLegend公司），Vimentin、CD68一抗（美國Santa Cruz公司），Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司），TRIzal試劑（賽默飛世爾科技中國有限公司），RT Master Mix試劑盒（上海力敏實業有限公司），GAPDH一抗（武漢賽維爾公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本收集與處理 采用膝關節穿刺術收集RA病人兩側滑膜。將滑膜組織置入含體積分數為0.10雙抗磷酸鹽緩沖液（PBS）的離心管中（存放冰盒）送檢。在生物安全柜中采用體積分數0.10的PBS清洗標本，并分離標本上血管和脂肪組織。將處理后標本分3份：第1份用于多聚甲醛固定;第2份處理成小塊，放入凍存管中置液氮罐內10 min，再置入-80 ℃冰箱中備用;第3份放入新培養皿中，用于提取FLS。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色及評分 RA滑膜常規進行HE染色后，采用光學顯微鏡觀察RA滑膜病理變化并記錄。滑膜HE染色評分標準見表1。

1.2.3 免疫組化染色 按照文獻方法[11]進行免疫組化染色。采用光鏡高倍視野觀察細胞改變。免疫組化染色半定量評分標準[12]如下。陽性細胞百分比評分：0分，無陽性細胞;1分，陽性細胞<25%;2分，陽性細胞25%～50%;3分，陽性細胞51%～75%;4分，陽性細胞>75%。陽性細胞染色強弱評分：0分，無著色;1分，淡黃色;2分，棕黃色;3分，棕褐色。

1.2.4 FLS分離與培養及細胞鑒定 FLS分離及培養參考文獻方法[13]進行。細胞鑒定采用PBS清洗第3代凍存FLS共2次，胰蛋白酶消化后終止消化。1 200 r/min離心5 min，去培養基、PBS清洗。加1 mL單細胞懸液，并加CD90、CD29抗體行免疫熒光染色，設陰性對照。避光孵育20 min，用PBS清洗，加緩沖重懸液，采用Rigel S2流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 qPCR檢測 提取細胞RNA后去培養基，PBS清洗后在培養板中滴入500 μL的RA2液混勻，吹打細胞移至內套管內。以12 000 r/min離心1 min，去外套管中液體，內套管內滴500 μL洗脫液;重復操作1次。棄外套管，將內套管移入新EP管內，在膜中央加入洗脫液30 μL，室溫下靜置后以12 000 r/min離心1 min，獲取細胞總RNA。取100 mg組織剪碎研磨，加入1 mL的TRIzal震蕩30 s，室溫放置至組織裂解。以8 500 r/min離心5 min取上清液，加氯仿200 μL，震蕩30 s，室溫放置;再離心15 min取上清液，加等量異丙醇，室溫靜置10 min，再離心10 min，棄上清液，加500 μL體積分數0. 75的乙醇，離心5 min; 重復此操作。將沉淀存放室溫晾干，加10～20 μL的 DEPC液溶解RNA后，提取組織RNA。應用微量分光光度儀分別檢測細胞和組織RNA濃度。使用 RT Master Mix試劑盒，反轉錄cDNA保存于-20 ℃冰箱中備用。qPCR反應采用兩步法進行：①預變，195 ℃條件下持續30 s;②PCR，40、90 ℃條件下進行5 s反應或60 ℃條件下進行30 s反應。qPCR反應體系按照試劑盒說明配制，所用引物及其序列見表2。

1.2.6 Western blot方法 細胞、組織蛋白提取后備用。取電泳緩沖液粉，參照說明書溶解于1 L純水內制成電泳緩沖液。200 A電泳90 min轉膜后，取出膜用50 g/L脫脂牛奶室溫閉封2 h。加入一抗（1∶2 000 GAPDH抗體，1∶1 000 ZNRF3抗體）4 ℃冰箱搖床上搖動孵育10 h。次日洗膜3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，再洗膜3次。取ECL試劑A、B底物液1∶1混勻，將沖洗后的膜置入避光反應后進行顯影。使用Adobe Photoshop測量各條帶灰度值，采用相對灰度值表示蛋白表達量。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0統計軟件對數據進行分析。計量資料數據用±s表示，組間均數比較采用t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 兩側滑膜組織HE染色評分比較

觀察組炎性細胞浸潤、纖維組織增生、滑膜細胞增生和新生血管形成等評分均高于對照組，差異均有統計學意義（t=54.243～98.522，Plt;0.05）。見表3和圖1。

2.2 FLS細胞形態觀察

本研究觀察到FLS細胞核呈卵圓形，位于細胞中部，細胞形態呈梭形、星形和紡錘狀，邊界清晰，周圍見聚集性分泌物，還混雜卵圓形巨噬樣滑膜細胞（MLS）。細胞傳至第3代，MLS分裂、增殖作用喪失，其后FLS、RA-FLS、C-FLS細胞形態相似。從原代FLS細胞圖可見觀察組（圖2a、b）生長速度較對照組（圖2c、d）增快。

2.3 FLS細胞鑒定

本研究的細胞檢測抗體為CD90、CD29，用于第3代RA-FLS、C-FLS細胞鑒定，若兩者陽性率超過90%，則表示提取細胞為純化FLS。本文檢測結果表明，CD90、CD29兩者陽性率為93.19%，提示提取細胞為純化FLS。見圖3。

2.4 ZNRF3在病人兩側滑膜組織表達比較

ZNRF3在觀察組的免疫組化評分、mRNA和蛋白表達均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（t=8.963～105.292，Plt;0.05）。見表4和圖4。

2.5 ZNRF3在病人兩側滑膜FLS細胞中的分布與表達

免疫熒光法檢測結果顯示，ZNRF3（熒光綠）在RA-FLS和C-FLS的質膜、細胞質均有表達，但RA-FLS的熒光明顯強于C-FLS。見圖5。qPCR和Western blot檢測結果表明，ZNRF3在RA-FLS的mRNA和蛋白表達量均明顯高于C-FLS，差異均有統計學意義（t=43.330、62.721，Plt;0.05）。見表5和圖6。

3 討" 論

ZNRF3是一種調控蛋白，其細胞外結構與R脊柱蛋白相互作用，與富含亮氨酸的G蛋白偶聯受體生成復合物，致使ZNRF3自動膜清除、泛素化，使胞膜表面卷曲受體蛋白穩定，維持Wnt信號活性通路;細胞表面ZNRF3結合巢亂蛋白某區，識別Wnt巢亂蛋白，誘導該蛋白泛素化降解，從而抑制Wnt信號通路[14-16]。有學者認為，ZNRF3對Wnt/β-catenin、Wnt/PCP信號通路呈負性調控性[17]。

目前關于ZNRF的研究以腫瘤為主。已有學者指出，在腫瘤疾病中R-spondin-ZNRF3板塊常發生突變[18]。有研究表明，ZNRF3對Wnt/β-catenin信號通路的調控屬負性，其在腫瘤組織中表達不盡相同[19]。有學者對乳頭狀甲狀腺癌組織與正常甲狀腺組織的研究結果顯示，ZNRF3在乳頭狀甲狀腺癌組織內呈下調，且與其分化等級呈負相關[20-21]。而ZNRF3在原發性結直腸癌表達上調[22]。ZNRF3在骨關節的研究有待明確，但考慮RA病變與Wnt信號通路存在聯系，推測ZNRF3可能與RA病變的發生發展有關。

本研究對膝關節RA病人的RA側與C側滑膜組織、細胞采用免疫組化、qRCR和Westen blot法研究顯示，病人RA側滑膜組織中ZNRF3表達高于C側。相關研究已表明，RA側Wnt信號通路與其組織發病有關;在RA側組織、FLS中，β-catenin表達上調，表示Wnt通路過度激活，并抑制RA側的成骨細胞[23-25]。由此推測，ZNRF3在RA側滑膜組織中表達增高與Wnt信號通路在滑膜炎癥中過度激活相關，ZNRF3在RA發病中可抑制被過度激活的Wnt通路，而且呈負增長表達[26-27]。進一步分析ZNRF3在RA發病中的作用，采用酶消法從滑膜組織中分離原代FLS細胞，使用Ⅱ型膠原酶將組織離散成單個細胞，并用含FBS培養基培養數天，使細胞貼壁達80%～90%[28-30]。本文光鏡下觀察顯示，經HE染色的RA側滑膜組織明顯增生，細胞

層數增加，并見大量炎性細胞浸潤滑膜間質中，且伴大量新生血管生成，部分組織中見淋巴濾泡形成、間質纖維化。本文應用流式細胞檢測術、免疫熒光檢測對第3代細胞進行鑒定，并觀察ZNRF3在FLS中的表達，結果顯示，RA-FLS和C-FLS中ZNRF3均定位于細胞質和質膜，RA-FLS中ZNRF3表達明顯增高，而C-FLS中無明顯表達，qRCR與Westen blot檢測結果也相同。上述結果均提示，激活Wnt信號通路后可誘導ZNRF3生成并在細胞核外分泌，從而調控Wnt信號通路活性。

總而言之，RA病人病變側滑膜組織、FLS中的ZNRF3表達量升高，推測與Wnt信號通路過度激活誘導ZNRF3生成增加有關，而ZNRF3高表達可負反饋調節Wnt通路活性。

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（本文編輯 于國藝）