通過生物信息學分析預測肺鱗癌病人預后的免疫信號

[摘要] 目的 基于免疫相關基因（IRGs）構建肺鱗癌（LUSC）病人預后風險模型。

方法 從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫下載551例LUSC病人的基因表達譜，并從ImmPort數據庫中獲得IRGs，再利用R軟件篩選差異表達的免疫相關基因（DEIRGs）;構建轉錄因子調控網絡，探討其異常表達的機制。應用單變量Cox回歸確定DEIRGs的預后價值，應用Lasso回歸和多變量Cox比例風險回歸構建預后風險模型，并對模型的預測性能進行驗證。評估這些危險因素與各種臨床變量和免疫浸潤細胞之間的關系。

結果 由PLAU、JUN、RNASE7、FOS、IGGD3-22、IGKV1-6、SEMA4C、APLN、FGFR4和TRAV39共10個IRGs構成的風險模型顯示出良好的預測性能，有望成為預測LUSC病人預后的獨立因素，且該模型還能對不同預后的病人進行分層，風險評分高的病人更容易出現免疫細胞浸潤。

結論 IRGs可用于評估LUSC病人的預后和腫瘤免疫微環境的狀態。

[關鍵詞] 肺腫瘤;轉錄因子;計算生物學;ROC曲線;預后

[中圖分類號] R734.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0679-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.169

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210909.1511.001.html;2021-09-09 17：35：37

A BIOINFORMATICS ANALYSIS OF IMMUNE SIGNALS FOR PREDICTING THE PROGNOSIS OF PATIENTS WITH LUNG SQUAMOUS CELL CARCINOMA

FAN Yuqiao， LIN Mei， XU Wenhua

（Qingdao University Medical College， Medical Inspection Department， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To establish a prognostic risk model for patients with lung squamous cell carcinoma （LUSC） based on immune-related genes （IRGs）.

Methods The gene expression profiles of 551 LUSC patients were downloaded from The Cancer Genome Atlas （TCGA） database， and IRGs were obtained from the ImmPort database. R software was used to screen out differentially expressed IRGs （DEIRGs）， and a transcription factor regulatory network was constructed to investigate the mechanism of abnormal expression. A univariate Cox regression analysis was used to investigate the prognostic value of DEIRGs; Lasso regression analysis and multivariate Cox proportional-hazards regression model were used to construct a prognostic risk model， and the predictive performance of this model was verified. In addition， the association of these risk factors with various clinical variables and immune infiltrating cells was evaluated.

Results The risk model based on the 10 IRGs of PLAU， JUN， RNASE7， FOS， IGGD3-22， IGKV1-6， SEMA4C， APLN， FGFR4， and TRAV39 showed good predictive performance and was expected to be used as an independent factor for predicting the prognosis of LUSC patients. The model was able to stratify patients based on prognosis， and patients with high risk scores were more likely to develop immune cell infiltration.

Conclusion IRGs can be used to evaluate the prognosis of patients with LUSC and the state of tumor immune microenvironment.

[KEY WORDS] lung neoplasms; transcription factors; computational biology; ROC curve; prognosis

肺鱗癌（LUSC）是肺癌常見的亞型[1-2]，病人病死率高[3]。目前，LUSC治療策略主要包括手術、化療、靶向治療和免疫治療。早期病人多采用手術切除治療，晚期則以化療為主[4]，但后者預后不佳[5-6]。致癌基因的發現對肺癌的治療策略選擇產生了重大的影響，但LUSC病人很少發生表皮生長因子受體（EGFR）基因突變和間變性淋巴瘤激酶（ALK）易位，這限制了其靶向分子治療的選擇[7-10]。目前，免疫治療成為提高LUSC病人生存率的重要方法[11]，阻斷免疫檢查點通路是抗腫瘤治療的熱點[12-14]。然而，一些病人對免疫檢查點抑制劑不敏感[15]。有研究結果表明，免疫相關基因（IRGs）不僅與病人的預后有關，還通過影響腫瘤免疫微環境影響病人對免疫治療的敏感性[16]。本研究旨在開發一種基于多個IRGs的預后信號，評估LUSC病人的預后及對免疫治療的敏感性。

1 資料和方法

1.1 數據采集

數據資源下載于TCGA數據庫（http：//portal.gdc.cancer.gov/）。①登錄TCGA數據下載官網（https：//portal.gdc.cancer.gov/），點擊Repository，進入數據存儲地;②點擊Case，選擇腫瘤原發部位、項目、疾病類型;③點擊Files，選擇基因表達的測序數據HTSeq-FPKM進行下載（https：//gdc-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/latest/TCGA-LUSC.htseq_fpkm.tsv.gz）。其中包括所有病人的基因表達譜和臨床統計數據，總共獲得了502例LUSC組織和49例正常肺組織。臨床信息包括病人的年齡、性別、TNM分期、T分期、N分期、M分期、生存時間和生存狀態。從ImmPort數據庫（http：//www.immport.org）下載了2 483個IRGs[17]。

IRGs根據功能不同，分為細胞因子、腫瘤壞死因子家族受體、B細胞受體信號通路和白細胞介素等17個免疫類別。從AnimalTFDB（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/）下載了1 665個轉錄因子。

1.2 差異表達免疫相關基因（DEIRGs）的鑒定

從TCGA數據庫下載LUSC及正常肺組織樣本，用R軟件（3.6.1版）進行分析，鑒定腫瘤組織和正常肺組織之間差異表達的基因。使用火山圖和熱圖對篩選出的差異表達基因進行可視化處理，分別通過R軟件的ggplot2包和pheatmap包進行構建。然后，從中篩選IRGs，獲得DEIRGs。

1.3 轉錄因子調控網絡

構建轉錄因子調控的網絡，通過R軟件分析LUSC和正常肺組織間差異表達的轉錄因子，并構建火山圖和熱圖;然后建立轉錄因子調控網絡，探討其與DEIRGs的關聯性。

1.4 模型建立與驗證

從TCGA數據庫中選取有完善預后信息的LUSC病人215例，隨機分為訓練集（n=108）和測試集（n=107）。在訓練集中建立風險回歸模型，并在測試集中進行驗證。通過單變量Cox回歸分析，確定與預后相關的風險基因。通過Lasso回歸分析，去除彼此之間高度相關的風險基因;通過多變量Cox回歸分析建立與預后相關的風險回歸模型。

1.5 生存分析

根據預后模型計算每個LUSC病人風險評分。以中位風險評分作為臨界值，將LUSC病人分為低風險組和高風險組，用R軟件中的survival包繪制Kaplan-Meier生存曲線，散點圖示病人隨訪時間。

1.6 腫瘤免疫微環境分析

使用腫瘤免疫微環境估計資源（TIMER，http：//cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/）算法[18]，分析預后模型的風險評分與腫瘤浸潤免疫細胞之間的相關性。

1.7 統計分析

應用R軟件包limma進行差異表達基因分析，采用Benjamini-Hochberg法進行校正，以|log2 fold change（FC）|gt;1和FDR<0.05作為篩選差異基因的標準。應用R軟件中survival包分析受試者工作特征（ROC）曲線，ROC曲線下面積（AUC）gt;0.60被認為是一個可接受的預測模型，而AUCgt;0.70被認為具有顯著的預測價值[19-20]。比較高風險組和低風險組的臨床參數，連續變量比較采用t檢驗，分類變量比較采用χ2檢驗、對數秩檢驗和Cox比例風險回歸模型。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結" 果

2.1 DEIRGs的鑒定

根據TCGA數據庫，共鑒定出8 478個差異表達的基因。其中，與正常肺組織相比較，LUSC組織中有5 893個基因表達上調，2 585個基因表達下調。從獲得的差異表達基因中進一步篩選出593個DEIRGs，在這17個當中，307個DEIRGs表達上調，286個DEIRGs表達下調。

2.2 轉錄因子調控網絡

共發現了70種在正常肺組織和LUSC組織之間顯著差異表達的轉錄因子，其中17個與DEIRGs異常表達顯著相關（rgt;0.4，Plt;0.05）。在這17個當中，3個轉錄因子負調控IRGs的表達，14個轉錄因子正調控IRGs的表達。

2.3 與預后相關的DEIRGs的鑒別

單變量Cox回歸分析表明，共有24個DEIRGs與LUSC病人的預后顯著相關（Plt;0.01）（圖1）。

2.4 風險模型中與預后相關的DEIRGs的鑒定

基于預后指標對LUSC病人總體生存率的影響，進一步篩選預后指標，構建基于訓練集數據的Cox回歸風險模型。Lasso回歸分析獲得了14個候選基因（圖2），經多變量Cox比例風險回歸分析最終獲得了10個高危基因，分別為PLAU、JUN、RNASE7、FOS、IGGD3-22、IGKV1-6、SEMA4C、APLN、FGFR4和TRAV39。這10個基因均與LUSC病人預后不良有關。

2.5 基于訓練集的預后風險模型

為了探討風險基因在評估LUSC病人預后中的意義，使用以下公式計算每個病人的風險評分：風險評分=（0.002 071 216×PLAU的表達量）+（0.005 001 859×JUN的表達量）+（0.011 714 662×RNASE7的表達量）+（0.001 904 47×FOS的表達量）+（0.008 147 631×IGGD3-22的表達量）+

（0.000 379 557×IGKV1-6的表達量）+（0.013 048 762×SEMA4C的表達量）+（0.061 256 145×APLN的表達量）+（0.059 219 257×FGFR4的表達量）+（0.397 970 139×TRAV39的表達量）。以中位風險評分作為臨界值，將訓練集中的病人分為高風險組和低風險組。Kaplan-Meier曲線分析顯示，高風險組和低風險組在訓練集中的存活時間差異有顯著性（χ2=11.4，Plt;0.05）（圖3A）;時間相關的ROC曲線分析結果顯示，建立的預后模型可靠，ROC曲線AUC在3年和5年分別為0.721和0.715（圖3B、C），低風險評分病人的生存狀況優于高風險評分病人（圖3D、E）。熱圖分析結果顯示，與低風險組相比，高風險組10種風險基因的表達水平高于低風險組（圖3F）。

2.6 預后模型性能的驗證

分別在測試集和整個TCGA集中驗證建立的預后風險模型的預測性能。根據每個病人的風險評分，將測試集和整個TCGA集的病人分別按照風險評分中位數分為高風險組和低風險組，進一步繪制Kaplan-Meier曲線和時間相關的ROC曲線，比較高風險組和低風險組的3年生存率和5年生存率。結果表明，無論是在測試集還是整個TCGA集中，低風險組的生存率都高于高風險組（圖4A、B）。在測試集和整個TCGA集中，3年生存率AUC分別為0.631和0.679（圖4C、D），5年生存率AUC分別為0.634和0.692（圖4E、F）。與低風險組相比，高風險組病人生存狀況更差，風險基因表達水平更高。表明建立的預后風險模型具有良好的預測性能。

2.7 風險評分在整個TCGA集中的獨立預后價值

單變量Cox回歸分析顯示，病理分期（P=0.005）、T分期（P=0.005）和風險評分（Plt;0.001）與LUSC病人的生存結果顯著相關。多變量Cox回歸分析結果表明，風險評分可作為預測LUSC病人預后的獨立危險因素（Plt;0.001）。時間相關的ROC曲線分析顯示，3年時病理分期、T分期和風險評分的AUC分別為0.587、0.597和0.691，5年時分別為0.536、0.526和0.694。

2.8 預后模型的臨床有效性

基于整個TCGA集分析模型變量（風險基因和風險評分）和臨床變量（年齡、性別、病理分期和TNM分期）之間的關系顯示，隨著PLAU表達的增加，LUSC的T分期進展迅速（P=0.021）;不同年齡的病人某些危險基因的表達也不同，APLN

（P=0.038）、JUN（P=0.019）和PLAU（P=0.008）

在65歲以上LUSC病人中的表達水平明顯高于年輕病人;FGFR4在男性LUSC病人中的表達水平顯著高于女性病人（P=0.020）。風險評分與B細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等浸潤程度呈正相關（r=0.106～0.171，P<0.05）。表明風險評分能夠評估LUSC病人腫瘤免疫微環境的狀態。

3 討" 論

肺癌是一種病死率較高的惡性腫瘤，雖然近年來在診療方面取得了很大進展，但生存率仍然不容樂觀。免疫治療的興起及臨床應用為肺癌的診療手段提供了新的思路。越來越多的證據表明，腫瘤免疫微環境可以影響腫瘤的惡性表型[21-23]。在多種惡性腫瘤中，免疫浸潤與臨床結果密切相關[24-25]，尤其是在肺癌中[26-27]。本文研究基于TCGA數據庫，確定了與預后相關的DEIRGs，并構建了一個預后風險模型來評估LUSC病人的生存結果及腫瘤免疫微環境的狀態。

本研究分析了LUSC組織和正常肺組織之間DEIRGs，并構建了轉錄因子調控網絡，得到17個轉錄因子與IRGs異常表達相關。表明腫瘤轉錄因子可能通過調節IRGs的表達來影響LUSC病人的預后。本研究還探討了DEIRGs與LUSC病人預后之間的相關性，并評估了與LUSC預后相關的DEIRGs在預測病人預后中的效率。通過Lasso回歸分析，最終獲得10個風險基因，納入預后風險模型，并在整個TCGA數據集中進行驗證。本文研究結果表明，本文建立的預后模型能夠有效區分不同風險的病人，風險評分可作為預測LUSC病人預后的獨立因素，且優于其他臨床參數。因此，風險模型可用于篩查高危病人，以便通過早期治療改善預后。本文研究評估了危險因素和一些臨床變量之間的關系，結果顯示，一些風險基因的表達與LUSC進程呈正相關，表明所構建的風險模型能夠有效預測LUSC進程。

免疫療法在肺癌的治療中顯示出不同的臨床效果，這部分取決于腫瘤浸潤淋巴細胞的數量和特征[28-29]。有研究認為，肺惡性腫瘤中浸潤的免疫細胞可能對病人的免疫治療反應和預后產生重要影響[22]。本文分析了風險評分與腫瘤浸潤免疫細胞之間的關系，結果表明，病人風險評分越高，免疫細胞浸潤程度越高，說明風險模型在評估LUSC生存結果中可信度較高。

基于IRGs的風險模型被廣泛用于評估多種惡性腫瘤病人的預后。本文研究具有以下優勢：①分析了IRGs在LUSC中的表達模式;②進行Lasso回歸，刪除彼此高度相關的基因，增加了結果的可信度;③所建立的模型不僅可用于預測LUSC病人的預后，還可用于評估病人腫瘤免疫微環境的狀態，從而輔助制定個性化的治療方案。

綜上所述，本文通過生物信息學分析，得到了基于IRGs的預后信號，該信號可用于評估LUSC病人的預后和腫瘤免疫微環境的狀態，從而幫助制定個性化的治療方案，提高病人的生存率。

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（本文編輯 黃建鄉）