川芎嗪對支氣管上皮細胞ORMDL3表達影響

[摘要]目的 探討川芎嗪對哮喘易感基因血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）表達的影響。方法 應用IL-4+IL-13刺激人支氣管上皮（HBE）細胞ORMDL3過表達，以不同濃度的川芎嗪（200、300、400、500、600、700、800 μg/L）干預72 h，選取干預作用最明顯的川芎嗪濃度。以IL-4+IL-13培養的HBE細胞作為模型組，以干預作用最明顯的川芎嗪濃度干預IL-4+IL-13培養HBE細胞作為治療組，PBS培養HBE細胞作為空白組。應用RT-PCR方法分別檢測3組ORMDL3 mRNA表達，Western blot方法、免疫組化法檢測ORMDL3蛋白表達。結果 400 μg/L濃度的川芎嗪干預作用最明顯。治療組、空白組、模型組ORMDL3 mRNA表達比較差異有顯著性（F=176.45，Plt;0.01），治療組表達最低。模型組、治療組ORMDL3蛋白表達較空白組升高，治療組較模型組降低，差異有統計學意義（F=23.48、91.56，Plt;0.01）。結論 川芎嗪可通過下調HBE細胞ORMDL3基因表達，改善哮喘病人氣道重塑。

[關鍵詞]哮喘;血清類黏蛋白;川芎嗪

[中圖分類號]R287.5

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0276-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of ligustrazine on the expression of the asthma susceptibility gene orosomucoid 1-like protein 3 （ORMDL3） in serum. "Methods Human bronchial epithelial cells （HBECs） were stimulated by interleukin-4 （IL-4） and interleukin-13 （IL-13） to induce the overexpression of ORMDL3， and ligustrazine at different concentrations （200， 300， 400， 500， 600， 700， and 800 μg/L） was used for intervention for 72 h to screen out the concentration of ligustrazine with the most significant intervention effect. HBECs cultured with IL-4+IL-13 were selected as model group; HBECs cultured with ligustrazine at the concentration with the most significant intervention effect were selected as treatment group; HBECs cultured with phosphate-buffered saline were selected as blank group. RT-PCR was used to measure the mRNA expression of ORMDL3， and Western blot and immunohistochemistry were used to measure the protein expression of ORMDL3. "Results Ligustrazine at the concentration of 400 μg/L had the most significant intervention effect. There was a significant difference in the mRNA expression of ORMDL3 between the treatment group， the blank group， and the model group （F=176.45，Plt;0.01）， and the treatment group had the lowest expression of ORMDL3. The model group and the treatment group had significantly higher protein expression of ORMDL3 than the blank group， and the treatment group had significantly lower expression than the model group （F=23.48，91.56;Plt;0.01）. "Conclusion Ligustrazine can improve airway remodeling in asthmatic patients by downregulating ORMDL3 gene expression in HBECs.

[KEY WORDS]asthma; orosomucoid; tetramethylpyrazine

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病。哮喘慢性氣道炎癥最終導致氣道的持續性損傷而致氣道結構異常，即氣道重塑。氣道重塑是哮喘的重要病理特征，顯著影響哮喘的預后。哮喘的發生發展與遺傳因素和環境因素有關，其中哮喘易感基因發揮重要作用。血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）基因是一種哮喘關聯基因，與哮喘氣道重塑的發生、發展密切相關[1]。吸入布地奈德可以減少ORMDL3表達，并減輕氣道重塑的嚴重程度，二者有明顯相關性[2]。然而，長期大劑量使用糖皮質激素會產生較大副作用，誘發或加重感染，抑制機體的免疫功能 [3-4]。川芎嗪為中藥川芎主要有效成分，是一種應用廣泛的中藥活性成分，臨床用于治療冠狀動脈疾病、缺血性腦血管疾病以及腫瘤等[5]。有研究表明，川芎嗪具有多種生物活性，如抗氧化活性、對多種腫瘤細胞的細胞毒性、抑制血管平滑肌細胞增殖、預防內皮細胞損傷等[6]，川芎嗪還能抑制成纖維細胞合成膠原纖維[7]。還有研究顯示，川芎嗪有影響哮喘病人氣道重塑的能力[8]。然而其作用機制尚未闡明。本研究旨在觀察川芎嗪對ORMDL3表達影響，為早期防治哮喘氣道重塑提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人支氣管上皮（HBE）細胞（上海博古生物科技有限公司，CBNumber：CB35771380）;南美胎牛血清（FBS，維森特生物技術有限公司）;Trizol （上海普飛公司）;四甲基吡嗪（美國Sigma公司）;Primer、二甲基亞砜（DMSO）、MTT（上海吉凱基因醫學科技股份有限公司）;RNase Inhibitor （Promega公司）;SYBR Master Mixture（TAKARA）;oligo dT （生工生物工程（上海）有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養 HBE細胞加入RPMI-1640培養液（含體積分數0.10的FBS，10 000 kU/L青霉素、10 g/L鏈霉素）中，置于培養箱（37 ℃，含體積分數0.05 CO2）中培養，隔天換液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞長至80%表面面積時傳代。

1.2.2 藥物作用時間選擇 取對數生長期HBE細胞接種于 96 孔板，每孔加入 1×104 個細胞，應用含有體積分數0.10 FBS的RPMI-1640培養液，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2、飽和濕度條件下培養24 h。另設空白組、對照組（加入相應體積的PBS）。每組設 6個平行復孔。分別培養24、48、72 h后，加入MTT溶液，培養箱孵育4 h。離心去上清后加入DMSO溶液，酶標儀檢測570 nm 波長處吸光度（A）值。計算細胞存活率。細胞存活細胞率（%）=（實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.2.3 川芎嗪濃度選擇及實驗分組 以100 μg/L的IL-4+IL-13培養的HBE細胞為模型組，分別加入不同濃度的川芎嗪（200、300、400、500、600、700、800 μg/L）作用72 h，觀察川芎嗪對IL-4+IL-13誘導HBE細胞ORMDL3 mRNA干預作用。以作用最明顯的川芎嗪濃度作為實驗濃度，將實驗濃度的川芎嗪加入100 μg/L IL-4+IL-13培養HBE細胞作為治療組，以100 μg/L IL-4+IL-13培養HBE細胞為模型組，以PBS培養HBE細胞作為空白組。3組培養時間均為72 h。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 RT-PCR方法檢測ORMDL3 mRNA表達

取各組培養后的HBE細胞，采用Trizol法提取mRNA，按照RT-PCR試劑盒說明書將mRNA反轉錄成cDNA，使用RT-PCR方法檢測ORMDL3 mRNA表達。所用引物及其序列見表1。反應體系20 μL，內含：反轉錄產物5 μL，上下游引物共5 μL，SYBR Green 10 μL。以GAPDH為內參照。反應條件為：95 ℃，預變性30 s，1個循環;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、5～10 min，1個循環。

1.3.2 Western blot方法檢測ORMDL3蛋白表達

取培養后的各組細胞，加入200 μg/L的RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min。取上清液，行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉移至PVDF膜上，加入50 g/L脫脂奶粉，室溫封閉2 h。加入兔抗人ORMDL3抗體（1∶200稀釋），4 ℃冰箱過夜，室溫下TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗，常溫孵育2 h;TBST室溫下洗膜3次，光化學法顯影，用Image J軟件掃描各條帶灰度值，以β-action（1∶200稀釋）為內參照，以各條帶灰度值/內參照灰度值表示ORMDL3蛋白表達。

1.3.3 免疫組化檢測ORMDL3蛋白表達 取各組細胞，制作細胞爬片。血清封閉，PBS漂洗，向切片上分別滴加ORMDL3抗體（Abcam107639，1∶200稀釋）孵育過夜，PBS漂洗，二抗孵育，DAB顯色。光學顯微鏡下觀察，細胞棕色著色為ORMDL3蛋白陽性表達。應用Image J軟件計算ORMDL3蛋白相對表達量。

1.4 統計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料結果用x2±s表示。數據間比較先進行方差齊性檢驗，方差齊則進行方差分析， 若方差不齊則進行Welch’s分析。

2 結 果

2.1 不同培養時間細胞存活率及不同藥物濃度組ORMDL3 mRNA表達比較

培養24、48、72 h細胞存活率分別為（90.13±1.96）%、（94.51±1.91）%、（97.22±1.91）%，各時間比較差異有顯著性（n=6，F=20.60，Plt;0.05），培養72 h細胞存活率最高。后續實驗以72 h為藥物培養時間。200、300、400、500、600、700、800 μg/L濃度的川芎嗪作用HBE細胞72 h，其ORMDL3 mRNA表達分別為2.472±0.178、0.763±0.058、0.823±0.142、0.994±0.059、0.978±0.038、1.084±0.079、0.947±0.036，各組比較差異有顯著性（n=6，F=5.34，Plt;0.05）。400 μg/L川芎嗪對IL-4+IL-13誘導HBE細胞血清ORMDL3 mRNA表達的干預作用最明顯。后續實驗以400 μg/L為川芎嗪藥物濃度。

2.2 各組ORMDL3 mRNA表達比較

空白組、模型組、治療組ORMDL3 mRNA表達分別為0.947±0.036、1.000±0.0371、0.763±0.058，各組ORMDL3 mRNA比較差異有顯著性（n=6，F=176.45，Plt;0.01）。

2.3 各組ORMDL3蛋白表達比較

Western blot及免疫組化檢測結果均顯示，模型組、治療組ORMDL3蛋白表達較空白組升高，治療組較模型組降低，差異有統計學意義（F=23.48、91.56，Plt;0.01）。見表2和圖1、2。

3 討 論

哮喘病因為痰、虛、瘀，痰瘀互結是哮喘發作期的主要病機，治療應以治痰活血并重。《讀醫隨筆》云：“痰為血類，停痰與瘀血同治。”唐容川《血證論》說：“須知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血則痰水自消。”哮喘的病機是“內有壅塞之氣，外有非時之感，膈有膠固之痰。”臨床研究發現，對于哮喘發作期及緩解期的寒哮、熱哮證，川芎都有顯著的療效[9]。哮喘病兒久病正氣不足，伏痰內生，氣虛血瘀，故痰瘀互結是哮喘的主要病因病機。血瘀證貫穿于哮喘的始終。《本草綱目》有云：“川芎者，血中之氣藥。”川芎辛溫香燥，走而不守，既能行散，上達巔頂;又入血分，下行可達血海，為血中之氣藥，能通達氣血，活血祛瘀之功效顯著。

現代醫學研究認為，哮喘屬于多基因遺傳病，由環境因素和遺傳因素共同作用而形成。ORMDL3基因位于17號染色體上，包括3個外顯子和2個內含子，編碼1個位于內質網膜的跨膜蛋白，可以通過調節Ca2+濃度導致未折疊蛋白反應，為哮喘炎性反應發生的內源性誘因[10]。哮喘的一個重要的病理特點是氣道重塑。氣道重塑可發生于成人及兒童哮喘病人，而ORMDL3基因高表達的兒童哮喘可能會加速早期氣道重塑的進程[11]。既往研究已顯示，ORMDL3過表達的轉基因小鼠模型可出現氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應性和IgE水平升高[12]。

川芎嗪是川芎生物堿的主要成分之一，在我國被用于改善血液循環及緩解疼痛至少有2 000年的歷史。川芎嗪（化學名稱四甲基吡嗪）是自中藥川芎分離提純出來的一種酰胺生物堿，是一種鈣離子拮抗劑，可影響器官血液流變學參數，有擴張血管、減輕炎癥、抗脂質過氧化、抑制鈣超載、減輕纖維化、抑制血小板聚集等作用。另外，川芎嗪還有降低氣道高反應、改善氣道炎癥、調節免疫等作用[13-14]。

研究發現，川芎嗪對過敏性炎癥反應和氣道重塑具有抑制作用[16-17]。哮喘發病的主要機制是慢性氣道炎癥，而持續的慢性氣道炎癥可以引起氣道重塑。已有研究表明，HBE細胞在過敏原和細胞因子（IL-4和IL-13）刺激下可誘導ORMDL3表達[15];ORMDL3可通過激活ERK1/2/MMP-9信號通路影響哮喘氣道炎癥和氣道重塑進展[16-18]。本研究應用IL-4+IL-13誘導HBE細胞ORMDL3過表達作為哮喘細胞模型，探討川芎嗪對氣道重塑的影響。結果顯示，IL-4、IL-13可誘導HBE細胞ORMDL3 mRNA過表達，400 μg/L濃度川芎嗪作用72 h可顯著降低IL-4+IL-13誘導的HBE細胞ORMDL3 mRNA和蛋白表達，說明川芎嗪可以抑制哮喘氣道炎癥和氣道重塑。其機制可能為：川芎嗪是一種鈣離子拮抗劑，可通過調節細胞內Ca2+濃度導致未折疊蛋白反應，從而減輕氣道炎癥反應，影響氣道重塑進程。其具體機制需要進一步的實驗證實。

綜上所述，川芎嗪可能通過阻斷IL-4+IL-13誘導所致HBE細胞ORMDL3蛋白過表達，在一定程度上改善哮喘氣道重塑。本文研究結果為川芎嗪治療哮喘及其機制研究提供依據。

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（本文編輯 黃建鄉）