下調miR-141-3p對晚期NSCLC細胞侵襲轉移和化療敏感性影響及其機制

[摘要]目的 研究miR-141-3p介導Yes相關蛋白1（YAP1）基因表達對晚期非小細胞肺癌（NSCLC）細胞侵襲轉移和化療敏感性的影響及其作用機制。方法 收集50例晚期NSCLC及癌旁組織標本，采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測組織中miR-141-3p和YAP1表達量。選擇NSCLC細胞株，設計miR-141-3p inhibitor和siRNA-YAP1，將細胞分為Blank組、miR-141-3p mimic組、miR-141-3p inhibitor組、YAP1 vector組、siRNA-YAP1組和miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組。取對數生長期的細胞接種于96孔培養板，加10 mg/L順鉑置37 ℃、體積分數0.05 CO2條件下培養;觀察細胞遷移、侵襲、耐藥性的變化，并檢測miR-141-3p、YAP1、TGF-β信號通路相關蛋白TGF-β和Smad2表達。結果 與癌旁組織相比，晚期NSCLC中miR-141-3p和YAP1呈高表達（t=23.19、17.32，P均lt;0.05）。過表達miR-141-3p或YAP1能夠降低TGF-β和Smad2表達，促進癌細胞侵襲遷移，降低順鉑處理后細胞存活率（Tukey’s檢驗，P均lt;0.05）;而沉默miR-141-3p或YAP1能夠提高TGF-β和Smad2表達，抑制癌細胞轉移侵襲，提高順鉑處理后細胞存活率（Tukey’s檢驗，P均lt;0.05;F=82.670～181.000，P均lt;0.05）。結論 miR-141-3p下調可能通過抑制YAP1基因表達激活TGF-β信號通路，進而調控晚期NSCLC細胞侵襲轉移和化療敏感性。

[關鍵詞]癌，非小細胞肺;微RNAs;RNA干擾;TGF-β信號通路;腫瘤侵潤;腫瘤轉移;輻射耐受性;抗藥性，腫瘤

[中圖分類號]R730.26;R342.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0228-06

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of the gene expression of Yes-associated protein 1 （YAP1） mediated by miR-141-3p on the invasion， migration， and chemosensitivity of advanced non-small cell lung cancer （NSCLC） cells. "MethodsAdvanced NSCLC and adjacent tissue samples were collected from 50 patients， and quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction was used to measure the expression of miR-141-3p and YAP1. NSCLC cell line was selected， and miR-141-3p inhibitor and siRNA-YAP1 were designed. The cells were divided into blank group， miR-141-3p mimic group， miR-141-3p inhibitor group， YAP1 vector group， siRNA-YAP1 group， and miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1 group. The cells in the logarithmic growth phase were inoculated on a 96-well plate and cultured with 10 mg/L cisplatin at 37 ℃ and a volume fraction of CO2 of 0.05; the changes in cell migration， invasion， and drug resistance were observed， and the expression of miR-141-3p， YAP1， and proteins related to the TGF-β signaling pathway （TGF-β and Smad2） was measured. "Results Compared with the adjacent tissue， the advanced NSCLC tissue showed high expression of miR-141-3p and YAP1 （t=23.19，17.32;Plt;0.05）. Overexpression of miR-141-3p or YAP1 reduced the expression of TGF-β and Smad2， promoted the invasion and migration of cancer cells， and reduced cell viability after cisplatin treatment （Tukey’s test， Plt;0.05）， while silencing of miR-141-3p or YAP1 increased the expression of TGF-β and Smad2， inhibited the migration and invasion of cancer cells， and increased cell viability after cisplatin treatment （Tukey’s test， Plt;0.05;F=82.670-181.000，Plt;0.05）."Conclusion Downregulation of miR-141-3p may regulate the invasion， migration， and chemosensitivity of advanced NSCLC cells by inhibiting the expression of the YAP1 gene and activating the TGF-β signaling pathway.

[KEY WORDS]carcinoma， non-small-cell lung; microRNAs; RNA interference; TGF-β signaling pathway; neoplasm invasiveness; neoplasm metastasis; radiation tolerance; drug resistance， neoplasm

肺癌病死率位居惡性腫瘤的首位，多數病人確診時已是晚期失去手術機會，其預后極差，多歸因于目前缺乏有效的早期診斷途徑[1-4]。晚期非小細胞肺癌（NSCLC）病人多采用以化療為主的治療方案[5-6]。值得注意的是腫瘤治療效果與病人個體化特征密切相關，即便同一種治療方案應用于有著相似臨床診斷、臨床分期及藥物種類和劑量的不同患癌個體，亦可能產生不同反應。化療敏感性已成為衡量化療效果的主要指標[4]，而耐藥性在治療過程中很常見。微小RNA（microRNA）是一類非編碼RNA，可通過調節特定基因的表達，參與腫瘤發展進程[7]。近年來的研究表明，microRNA在肺癌的發展、診療、放化療敏感性等方面均發揮著重要作用[8-9]。例如，miR-141已被證實可作為NSCLC潛在的診斷標志物[10-11];miR-141-3p在對化療有效的NSCLC病人中呈低表達[12]。但目前關于miR-141-3p是否參與晚期NSCLC治療過程中化療敏感性機制的研究未見報道。本研究以體外實驗方式，采用細胞轉染探究miR-141-3p在NSCLC細胞系的表達，并探討其對晚期NSCLC化療敏感性的影響及其作用機制，為逆轉肺癌化療耐藥性提供臨床依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑和儀器 NSCLC細胞株A549（中國科學院腫瘤研究所）;順鉑（北京沃凱生物科技有限公司）;miR-141-3p模擬物（miR-141-3p mimic）、miR-141-3p抑制物（miR-141-3p inhibitor）、Yes相關蛋白1載體（YAP1 vector）、YAP1沉默表達（siRNA-YAP1）質粒和PCR引物（上海吉瑪公司）;Matrigel膠（上海玉博生物科技有限公司）;倒置顯微鏡（Leica公司，德國）;CCK8試劑（上海翊圣生物科技有限公司）;Trizol試劑（北京百奧森泰生物技術有限公司）;兩步法實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒（上海聯邁生物工程有限公司）;Western blot抗體（Abcam，UK）;ECL發光液（上海七海復泰生物科技有限公司）;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（翌圣生物科技（上海）有限公司）。

1.1.2 研究對象 2016年6月—2018年6月，選擇邯鄲市中心醫院不能手術的50例晚期NSCLC病人作為研究對象，術前均未接受放化療及免疫治療。其中男34例，女16例，年齡為22～71歲，平均年齡（54.12±6.67）歲。所有病例均經CT引導下經皮肺穿刺或支氣管鏡下黏膜活檢，并經病理證實為晚期NSCLC。同時，以24例手術切除的肺癌病人的癌旁正常肺組織（距病灶5 cm）為對照組。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組處理 收集NSCLC細胞株A549置于Kaighn’s F-12K培養基（補加有體積分數0.10胎牛血清（FBS）和青霉素/鏈霉素/真菌素），接種于24孔板，每孔500 μL，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2、100%濕度培養箱中孵育。根據細胞生長情況，每隔2～3 d傳代1次。將細胞分為6組：Blank組（A組，不做任何處理），miR-141-3p mimic組（B組，轉染miR-141-3p過表達質粒），miR-141-3p inhibitor組（C組，轉染miR-141-3p inhibitor質粒），YAP1 vector組（D組，轉染YAP1過表達質粒），siRNA-YAP1組（E組，轉染siRNA-YAP1質粒），miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組（F組，共轉染miR-141-3p inhibitor質粒和YAP1過表達質粒）。均采用Lipofectamine Transfection Reagent 2000（Invitrogen）介導細胞轉染。

1.2.2 qRT-PCR檢測 轉染48 h后，收集各組細胞，Trizol法提取細胞總RNA，并測定濃度和純度（組織檢測步驟同細胞檢測）。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作，置于PCR擴增儀，將樣品RNA反轉為cDNA，并進行qRT-PCR擴增。將基因上下游引物稀釋，加入PCR擴增體系，滅菌ddH2O補足至20 μL。目的基因以GADPH為內參照，使用實時PCR檢測系統平臺進行檢測。取Ct值，采用相對定量法計算，用2-△△Ct表示各目的基因相對表達量。每個實驗均重復3次，取其均值。

1.2.3 雙熒光素酶報告檢測 使用生物學預測網站進行miR-141-3p和YAP1的結合位點分析。克隆擴增YAP1的3’UTR區到pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體上，并命名為pWt-YAP1。同時構建pMut-YAP1載體，mimic-NC組與miR-141-3p mimic組分別與熒光素酶報告載體共轉染NSCLC細胞株A549，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.2.4 Transwell實驗 在各組轉染48 h后細胞板內，每孔上室加200 μL細胞懸液，下室加800 μL含有體積分數0.20 FBS的條件培養基。37 ℃培養箱孵育20～24 h。取出Transwell板，1 g/L甲紫溶液染色。晾干后用倒置顯微鏡隨機計數5個視野的細胞，并取平均值。實驗重復3次。

1.2.5 劃痕實驗 用Marker筆在6孔板背后均勻畫橫線（間距0.5～1.0 cm），橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。加入各組轉染48 h后的細胞，過夜培養，待細胞均勻鋪滿容器底面。次日用槍頭沿直尺劃痕。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基。放入37 ℃、體積分數0.05 CO2培養箱培養。取樣拍照。

1.2.6 CCK8檢測 使用體積分數0.10 FBS培養基配制成不同濃度的順鉑溶液，4 ℃儲存備用。取對數生長期的細胞接種于96孔培養板，置37 ℃、體積分數0.05 CO2條件下培養，取10 mg/L順鉑，加入96孔板中，設3個復孔。設置空白對照。48 h后，每孔加新配制的CCK8試劑10 μL，繼續孵育4 h，終止培養，小心吸去培養液。在酶聯免疫檢測儀上測定各孔450 nm波長處吸光度（A）。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.7 Western blot檢測 收集轉染培養48 h后的各組細胞，以PBS洗滌后重懸。離心取上清，加入RIPA裂解液，輕搖重懸后，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，即為細胞總蛋白。應用碧云天BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。取20 μg細胞總蛋白用100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，隨后濕法轉膜，使用50 g/L的脫脂奶粉封閉1.5 h。按照抗體說明書稀釋相應抗體于一抗稀釋液中。實驗所用的一抗如下：一抗兔抗人YAP1、一抗兔抗人TGF-β、一抗兔抗人Smad2及一抗兔抗人GAPDH多克隆抗體。加入相應HRP標記的二抗羊抗兔IgG抗體，在室溫下反應2 h，ECL發光液顯色，并曝光成像。采用Quanity One軟件進行蛋白條帶灰度分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件分析數據，計量資料數據以x2±s表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s檢驗。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 晚期NSCLC組織miR-141-3p和YAP1表達

通過對50例晚期NSCLC組織及24例癌旁組織的qRT-PCR檢測結果顯示，與癌旁組織比較，癌組織中miR-141-3p和YAP1表達均顯著升高，差異均有統計學意義（t=23.19、17.32，P均lt;0.05）。見圖1。

2.2 miR-141-3p對YAP1基因表達的調控

為研究miR-141-3p在NSCLC細胞中的靶向關系，通過生物學網站對其進行分析，結果顯示，miR-141-3p和YAP1存在結合位點。雙熒光素酶報告基因預測結果顯示，與mimic-NC組相比較，YAP1野生型3’UTR的熒光素酶活性能被miR-141-3p抑制（t=7.643，Plt;0.05），而對YAP1突變型3’UTR的熒光素酶活性沒有影響（Pgt;0.05）。說明miR-141-3p能特異性結合YAP1的3’UTR區并在轉錄后水平下調FANCM基因表達。見圖2。

差異有顯著意義（F=116.8，Plt;0.05）。與Blank組相比，miR-141-3p mimic組YAP1基因表達上升（Tukey’s檢驗，Plt;0.05），miR-141-3p inhibitor組YAP1基因表達下降（Tukey’s檢驗，Plt;0.05）。說明miR-141-3p表達能夠調控YAP1表達。見圖3。

2.4 miR-141-3p對晚期NSCLC細胞的增殖、遷移和耐藥性的影響

結果顯示，各組NSCLC細胞的增殖、遷移和耐藥性比較，差異有顯著意義（F=82.670～181.000，P均lt;0.05）。與Blank組相比，miR-141-3p mimic組和YAP1 vector組癌細胞侵襲、遷移能力明顯增強，順鉑處理后細胞存活率明顯增加，差異有顯著意義（Tukey’s檢驗，P均lt;0.05）;而miR-141-3p inhibitor組和siRNA-YAP1組癌細胞侵襲、遷移能力明顯減弱，順鉑處理后細胞存活率明顯降低，差異有顯著性（Tukey’s檢驗，P均lt;0.05）。Blank組和miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組各指標無顯著差異（Pgt;0.05）。說明miR-141-3p inhibitor+pcDNA-YAP1組逆轉了這一趨勢。見圖4、5。

2.5 miR-141-3p對TGF-β信號通路相關蛋白影響

Western blot檢測結果顯示，各組TGF-β信號通路相關蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=159.800、125.3000，P均lt;0.05）。與Blank組相比，miR-141-3p mimic組和YAP1 vector組TGF-β和Smad2表達水平明顯下降，而miR-141-3p inhibitor組和siRNA-YAP1組TGF-β表達水平明顯提高，差異有顯著性（Tukey’s檢驗，P均lt;0.05）。Blank組和miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組各項指標差異無顯著性（均Pgt;0.05）。見圖6。

3 討 論

microRNA已被證實在人類腫瘤的抗放化療機制中發揮重要作用。例如，LIU等[13]在其研究中利用microRNA分子譜分析法篩選與LASS2相關的microRNA，以為鑒別化療耐藥和化療敏感性提供依據，其結果發現miR-93抑制劑可增強si-LASS2轉染腫瘤細胞的化學敏感性。LANG等[14]報道，采用miR-24靶向沉默S100A8基因可提高子宮內膜癌細胞對紫杉醇的化療敏感性。劉娜等[15]在其研究中利用慢病毒表達載體轉染卵巢癌細胞株，構建miR-200a表達上調模型，并結合MTT實驗、PCR和免疫印跡檢測發現miR-200a可能通過調控耐藥相關ABC家族基因如ABCB3、ABCC1、ABCC2、ABCC3和ABCG2的表達，增加卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性。肖悅等[16]通過構建穩定表達miR-18a的白血病細胞轉染模型，發現miR-18a能夠通過靶定ATM調節白血病細胞HL-60對VP-16和VCR化療敏感性。鑒于microRNA能在基因編碼水平上反映腫瘤的耐藥性機制[17-19]，那么通過構建特定表達干預的細胞轉染模型，可有助于探究特定microRNA與腫瘤耐藥性的關聯及其作用機制。

在本研究前期，我們通過生物信息學方法篩選出晚期NSCLC過表達基因miR-141-3p，且在線生物學預測軟件報道miR-141-3p調控YAP1，YAP1在晚期NSCLC亦高表達，因此推測miR-141-3p通過調控YAP1影響晚期NSCLC。本研究首先通過qRT-PCR驗證組織中miR-141-3p和YAP1的表達。結果顯示，與癌旁組織相比，晚期NSCLC中miR-141-3p和YAP1呈高表達。進而，我們通過細胞轉染分為不同干預組別，探討了miR-141-3p對YAP1的調控關系，結果顯示，過表達miR-141-3p能夠促進YAP1基因和蛋白的表達，沉默miR-141-3p能夠抑制YAP1基因和蛋白的表達，說明miR-141-3p的表達能夠調控YAP1的表達。進一步研究結果表明，通過轉染miR-141-3p mimic或YAP1vector，相比Blank組，過表達miR-141-3p或YAP1能夠抑制TGF-β和Smad2表達，促進癌細胞侵襲遷移，增加細胞對順鉑耐藥性。而通過miR-141-3pinhibitor或si-YAP1轉染處理，則顯示沉默miR-141-3p或YAP1能夠提高TGF-β和Smad2表達，抑制癌細胞轉移侵襲，降低細胞對順鉑耐藥性。與此同時，Blank組和miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組各項指標無顯著差異，提示后者逆轉了這種趨勢。這說明miR-141-3p能夠通過YAP1促進晚期NSCLC細胞的增殖、遷移和耐藥。

基于以上實驗探究，我們推測，miR-141-3p下調可能通過抑制YAP1基因表達，激活TGF-β信號通路，進而調控晚期NSCLC細胞侵襲轉移和化療敏感性。值得注意的是，TGF-β家族是一類功能復雜的細胞因子，可廣泛參與各種病理生理過程，介導腫瘤細胞的分化與增殖[20-22]。TGF-β信號通路相關蛋白如Smad2，亦參與人類腫瘤進程，與乳癌、肺癌等發生發展相關[23-24]。TGF-β信號通路及其相關蛋白組成腫瘤抑制通路，介導腫瘤細胞生長，并且可激活一系列信號通路如MAPK、ERK等信號通路[25-26]。本研究中，miR-141-3p下調及YAP1基因表達抑制促進了TGF-β和Smad2表達的提升，進而激活TGF-β信號通路，對于降低順鉑耐藥性具有重要作用。既往研究已報道TGF-β信號通路與化療耐藥有關，并可通過調控TGF-β信號通路抑制腫瘤耐藥[27]。孫彩霞等[28]報道，轉染miR-141模擬物可降低卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2細胞對卡鉑的敏感性，提示檢測miR-141表達水平在預測卵巢癌對卡鉑敏感性、評估病人預后及其合理指導綜合治療等方面的臨床意義。

綜上所述，本文結果顯示，miR-141-3p下調可能通過抑制YAP1基因表達，激活TGF-β信號通路，進而調控晚期NSCLC細胞侵襲轉移和化療敏感性。本研究可為人類探討NSCLC耐藥機制提供新途徑，microRNA與NSCLC耐藥間的相關性將為逆轉其耐藥性提供一種全新的思路和策略。然而，本研究僅在細胞實驗中初步探究miR-141-3p對NSCLC影響的作用機制，是否存在其他潛在靶點及其作用機制均未可知，其將為今后研究的主要方向，進而為NSCLC的診治提供分子生物學依據。

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（本文編輯 于國藝）