褪黑素在人子宮基質(zhì)細胞增殖與分化過程中的作用

王婷婷，張 靜，黃吉成，柳 舒，岳占碰，楊占清，郭 斌(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

子宮基質(zhì)細胞在月經(jīng)分泌中期卵巢性激素的作用下可分化為蛻膜樣細胞，在形態(tài)和功能上發(fā)生一定的改變[1]。人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞在每個月經(jīng)周期中經(jīng)歷連續(xù)的增殖、分化以及動態(tài)組織重塑，成為蛻膜狀態(tài)。已有研究發(fā)現(xiàn)，子宮蛻膜異?？蓪?dǎo)致妊娠失敗、習(xí)慣性流產(chǎn)、先兆子癇等不良后果[2]。

褪黑素(melatonin,MT)是由松果體產(chǎn)生的一種吲哚類激素，在哺乳動物生殖過程中起重要作用。給小鼠補充褪黑素后，可以增加子宮內(nèi)膜腺體密度和子宮內(nèi)膜的厚度，顯著下調(diào)妊娠第6天小鼠血清中雌激素水平，而不改變孕激素水平[3]。在體外條件下，褪黑素可促進牛胚胎發(fā)育[4]。給兔補充褪黑素則會出現(xiàn)一些抗生殖機能的現(xiàn)象，表現(xiàn)為延緩性成熟，不利于自發(fā)性排卵和發(fā)情[5]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在子宮及胚胎中可以檢測到褪黑素跨膜受體的表達，褪黑素通過與膜受體的相互作用調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化等生理過程[6]。但有關(guān)褪黑素在子宮基質(zhì)細胞增殖與分化過程中的作用目前還不清楚。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是體內(nèi)一類由氧為主要成分的單電子還原產(chǎn)物，其中超氧陰離子(O2-)作為其主要成員介導(dǎo)多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可激活轉(zhuǎn)錄因子進而促進細胞的增殖和分化[7]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素具有清除ROS的能力[8]，但褪黑素是否可通過ROS來影響子宮基質(zhì)細胞的增殖與分化目前還不清楚。

本試驗通過體外培養(yǎng)人子宮基質(zhì)細胞系，添加褪黒素以及褪黑素受體抑制劑Luzindole后，利用流式細胞術(shù)、熒光定量PCR等方法，研究褪黑素在子宮基質(zhì)細胞增殖和分化過程中的作用及調(diào)節(jié)機制，為進一步探明子宮蛻膜化機理及提高受孕率等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞本試驗所用細胞為人子宮基質(zhì)細胞系(CRL-4003),購自ATCC公司。

1.2 主要試劑Dulbecco改良Eagle’s培養(yǎng)基和Ham’s F-12培養(yǎng)基以1∶1混合(Sigma)；活性炭處理的胎牛血清(Gibco)；褪黑素和Luzindole為Sigma產(chǎn)品；Trizol和實時熒光定量PCR試劑盒為Roche產(chǎn)品；超氧化物陰離子探針試劑盒和EdU-488細胞增殖檢測試劑盒為碧云天產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng)和處理將子宮基質(zhì)細胞復(fù)蘇后迅速移至含有10%活性炭處理的胎牛血清Dulbecco改良Eagle's和Ham's F-12 1∶1混合物配成的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長到對數(shù)生長期時，用含EDTA的胰酶消化鋪到6孔板中。取對數(shù)生長期細胞，血清饑餓24 h，分組如下：褪黑素處理組(MT)：使用10 μmol/L褪黑素處理子宮基質(zhì)細胞；對照組(CON)：加入等體積的含1/10無水乙醇的培養(yǎng)基；抑制劑組(MT+Luzin)：使用10 μmol/L Luzindole預(yù)處理2 h后，再加入10 μmol/L 褪黑素共處理。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞增殖子宮基質(zhì)細胞血清饑餓培養(yǎng)24 h，更換成含2%血清的培養(yǎng)基后再添加褪黑處理24 h，按照EdU-488細胞增殖檢測試劑盒說明書操作，通過流式細胞術(shù)檢測細胞增殖變化。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞增殖周期子宮基質(zhì)細胞血清饑餓培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基并添加褪黑素處理24 h，將細胞消化并1 200 r/min離心，棄上清。加入1 mL PBS將沉淀混勻，將細胞懸液緩慢滴入持續(xù)振蕩的3 mL 70%冰乙醇中，4℃固定過夜。PBS洗滌后，室溫下用0.5 mL PI/RNase染色緩沖液(BD biosciences)染色15 min，通過流式細胞術(shù)檢測細胞增殖周期變化。

1.6 熒光定量PCR根據(jù)GenBank中已發(fā)表的人子宮基質(zhì)細胞分化標志基因IGFBP1和PRL的mRNA序列，在基因編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計特異性引物(表1)。提取細胞總RNA，利用熒光定量PCR檢測細胞IGFBP1和PRL的mRNA表達水平。反應(yīng)體系、擴增條件和計算方法參照本實驗室操作方法進行[9]。

表1 PCR引物序列

1.7 子宮基質(zhì)細胞O2-水平檢測按1.3方法處理細胞，按照試劑盒說明書裝載探針，利用流式細胞術(shù)進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對子宮基質(zhì)細胞增殖的影響為了檢測褪黑素對子宮基質(zhì)細胞增殖的影響，血清饑餓后添加褪黑素作用24 h，按照EdU細胞增殖試劑盒說明書操作并應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加褪黑素后，細胞的增殖沒有明顯改變(圖1)。

A.流式細胞圖；B.褪黑素對子宮基質(zhì)細胞增殖的影響；CON.對照組；MT.褪黑素處理組。下同

2.2 褪黑素對子宮基質(zhì)細胞增殖周期的影響為了研究褪黑素對子宮基質(zhì)細胞增殖周期的影響，細胞血清饑餓后添加褪黑素處理24 h，經(jīng)消化、染色后通過流式細胞術(shù)檢測細胞的增殖周期。結(jié)果表明，與對照組相比，細胞增殖周期進程沒有明顯改變(圖2)。

A.流式細胞圖；B.褪黑素對子宮基質(zhì)細胞細胞增殖周期的影響

2.3 褪黑素對子宮基質(zhì)細胞分化的影響細胞經(jīng)饑餓誘導(dǎo)后，添加褪黑素分別處理各組細胞6、12、24 h，利用熒光定量PCR檢測細胞分化標志基因IGFBP1和PRL的mRNA表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，褪黑素處理組細胞中IGFBP1和PRL的表達量顯著降低(圖3)。

A.褪黑素對子宮基質(zhì)細胞IGFBP1表達的影響；B.褪黑素對子宮基質(zhì)細胞PRL表達的影響;*示差異顯著(P<0.05)。下同

2.4 Luzindole抑制褪黑素受體后褪黑素對子宮基質(zhì)細胞分化的影響在子宮基質(zhì)細胞中加入Luzindole預(yù)處理2 h后，再加入褪黑素作用12 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褪黑素可顯著抑制子宮基質(zhì)細胞中IGFBP1和PRL的表達，而添加Luzindole可減弱褪黑素對IGFBP1和PRL表達的抑制作用(圖4)。

圖4 Luzindole對褪黑素處理的子宮基質(zhì)細胞分化標志物IGFBP1(A)和PRL(B)mRNA表達的影響(MT+Luzin·MT+Luzindole處理組)

2.5 褪黑素對子宮基質(zhì)細胞中O2-的影響為了進一步研究褪黑素對子宮基質(zhì)細胞O2-含量的影響，結(jié)合DHE熒光探針，通過流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)超氧陰離子水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，褪黑素可引起細胞中超氧陰離子含量的明顯下降，而加入Luzindole可阻礙褪黑素對細胞中超氧陰離子含量的影響(圖5)。

A.對照組流式細胞圖；B.添加褪黑素處理后流式細胞圖；C.Luzindole與褪黑素共處理后流式細胞圖；D.褪黑素對子宮基質(zhì)細胞中O2-的影響

3 討論

人子宮內(nèi)膜是一種動態(tài)組織，需要經(jīng)歷循環(huán)再生，包括連續(xù)增殖、分化、分解和修復(fù)。當(dāng)胚泡植入子宮時，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞可經(jīng)歷廣泛的分化、血管重建和免疫細胞募集，這一過程被稱為蛻膜化，可為胎盤成熟前滋養(yǎng)發(fā)育中的胚胎提供營養(yǎng)[1]。已有研究證實，蛻膜化對于妊娠的建立和維持至關(guān)重要[10]，蛻膜化受到損傷時通常與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇以及在臨床環(huán)境中子宮內(nèi)生長受限和不明原因的不孕癥相關(guān)[11-12]。

褪黑素是由松果體所分泌產(chǎn)生的一種吲哚類激素，在哺乳動物胚胎發(fā)育、卵泡發(fā)育以及胚胎植入等過程中起著非常重要的作用。為了研究褪黑素對子宮基質(zhì)細胞增殖的影響，本試驗?zāi)M人口服褪黑素的濃度，利用流式細胞術(shù)檢測了細胞增殖的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褪黑素不影響子宮基質(zhì)細胞的增殖過程。向子宮基質(zhì)細胞中添加褪黑素后，利用流式細胞術(shù)檢測細胞增殖周期的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組與試驗組細胞基本都處于DNA復(fù)制前的G0/G1期，進一步證明了褪黑素對子宮基質(zhì)細胞增殖周期沒有明顯改變。提示褪黑素可能并不影響子宮基質(zhì)細胞的增殖過程。

IGFBP1和PRL是子宮基質(zhì)細胞發(fā)生分化的標志基因[2,13]。實時熒光定量檢測顯示褪黑素可以抑制細胞分化標志物IGFBP1和PRL mRNA的表達水平，表明褪黑素可顯著抑制子宮基質(zhì)細胞的分化水平。已有很多研究發(fā)現(xiàn)，在雌性動物的子宮中存在褪黑素受體，褪黑素可通過與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能[14-16]。在本研究中，Luzindole預(yù)處理細胞2 h后，再與褪黑素作用12 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)褪黑素對子宮基質(zhì)細胞分化抑制作用可得到恢復(fù)，這表明褪黑素可通過與細胞膜上的受體作用來調(diào)節(jié)子宮基質(zhì)細胞的分化水平。

ROS是需氧細胞在代謝過程中所產(chǎn)生的一種活性氧簇，包括O2-、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)和一氧化氮等，可作為一種信號分子來調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化。在小鼠精原干細胞中添加ROS清除劑后，ROS水平顯著減少，細胞的增殖與分化受到了明顯的抑制；而添加H2O2使ROS水平升高后，則可恢復(fù)精原干細胞的增殖與分化[17]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，補充褪黑素可使小鼠精原干細胞中ROS水平減弱[18]。為了明確子宮基質(zhì)細胞分化過程中褪黑素與ROS的關(guān)系，本研究利用流式細胞術(shù)檢測對照組、褪黑素組以及褪黑素與Luzindole共處理組細胞中的O2-水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，添加褪黑素可使子宮基質(zhì)細胞中O2-水平減少，而補充Luzindole則可減弱褪黑素對O2-的抑制作用，提示褪黑素可通過O2-來介導(dǎo)子宮基質(zhì)細胞的分化過程。

綜上所述，褪黑素可通過O2-來影響人子宮基質(zhì)細胞的分化，但對子宮基質(zhì)細胞增殖并沒有發(fā)生明顯的作用。