慢性熱應激對西門塔爾牛血清酶活性和免疫功能的影響

陳 浩,王純潔,斯木吉德,劉 波,敖日格樂* (.內蒙古農業大學 動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 0008;.內蒙古農業大學 獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 0008)

應激(stress)是機體對內部或外界各種非常刺激所產生的非特異性應答反應的總和[1]。動物在整個生產周期內，不斷遭受著飼養管理、噪聲及溫度等因素造成的應激，其中由環境溫度變化所導致的冷熱應激給畜禽生產帶來了極大的危害。奶牛屬恒溫動物，其單位體質量的散熱面積小而導致皮膚蒸發散熱困難，且在采食和泌乳等新陳代謝活動中產生大量熱量，因此夏季高溫季節極易引發奶牛熱應激[2]。一般認為，當環境溫度超過22℃或溫濕指數(THI)大于72時，奶牛處于熱應激狀態[3]。史彬林等[4]研究發現，當氣溫達到40℃時，奶牛采食量下降40%。薛白等[5]通過比較不同季節牛乳質量，發現與其他3個季節相比，夏季牛奶中乳蛋白率和乳脂率均出現不同程度的下降。PEREIRA等[6]報道，當日平均氣溫由33℃上升到41.7℃時，奶牛的受胎率由61.5%下降到31.0%。

環境溫、濕度的變化可引起動物血液中炎性因子和免疫球蛋白含量改變，降低動物機體細胞和體液免疫功能，奶牛血清中促炎因子的升高與炎癥的發生密切相關[7]。據研究報道指出，熱應激可顯著降低奶牛血清中免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)含量，并顯著降低初乳中免疫球蛋白G(IgG)含量[8-9]。張秩鳳[10]研究發現，與春季非應激狀態相比，夏季高溫、高濕環境下奶牛血清中IgG含量極顯著下降，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量極顯著升高。

目前關于反芻動物熱應激的研究報道主要集中于我國南方高溫、高濕條件下熱應激對反芻動物的影響。然而近年來的研究結果表明，根據綜合指數(CCI)回歸公式判定，呼和浩特市和北京市奶牛全年至少分別有144和131 d處于熱應激狀態[11-12]。此外，目前關于夏季高溫對內蒙古草原放牧西門塔爾牛的影響相關研究報道較少。因此，本研究擬以放牧條件下西門塔爾母牛為試驗群體，檢測試驗個體在熱應激與非應激狀態下的免疫指標和血清酶活性的差異，探討慢性熱應激對西門塔爾牛免疫功能和血清酶活性的影響，篩選可判別熱應激反應的血液生化指標，旨在為肉牛抗熱應激研究及當地篩選抗熱應激個體提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養管理本試驗在內蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區奧科斯牛場進行，以牧場提供的16頭體況健康、體質量相近的西門塔爾母牛為研究對象。全部試驗牛均在同一天然草場自然放牧(牧草營養成分見表1)，自由飲水(草場內有天然河流)。試驗分為熱應激期(2018年7月16日—7月20日)和非應激期(2018年8月26日—8月30日)兩個階段進行。

1.2 CCI測定本試驗以天然草場自然放牧的肉牛為研究對象，根據當地氣象資料記錄的溫度、相對濕度和風速，記錄日照時間并根據MADER等[13]提出的計算公式計算牧場的CCI。

1.3 血清制備和血液生化指標測定在各試驗期最后1 d清晨出牧前，每頭試驗牛頸靜脈采血10 mL，室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液分裝至1.5 mL離心管中，分離出的血清立即置于液氮罐中，帶回實驗室-20℃保存供測定血清生化指標。白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、TNF-α、IgA、IgG、IgM、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定過程均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 牧草營養成分和CCI測定結果綜合溫濕度、風速和日照時間的CCI是判斷肉牛熱應激的最準確的指數之一。以CCI作為熱應激的評定標準，當CCI>25時牛處于熱應激狀態。通過對放牧草場溫、濕度和CCI的測定，結果顯示在試驗第1階段草場最高溫度達到40.50℃，CCI在此期間平均高達29.61，表明此階段的西門塔爾牛遭受熱應激侵襲(表2)；而非應激期的平均溫度為22.82℃，CCI為20.37,均未達到肉牛產生熱應激的臨界值；表1結果顯示試驗期間牧草營養成分無顯著變化，符合試驗要求，可以進行下一步西門塔爾牛免疫及抗氧化功能比較研究試驗。

表1 放牧草場牧草概略養分(干物質基礎) %

表2 不同試驗期草場溫、濕度及CCI

2.2 西門塔爾牛免疫指標測定結果慢性熱應激對西門塔爾牛免疫指標影響的測定結果見表3。與非應激狀態相比，在熱應激狀態下，試驗牛血清中IL-2、IgA及IgG含量均顯著下降(P<0.05)，TNF-α和IL-1β含量顯著升高(P<0.05)，但IL-4和IgM含量無顯著性差異(P>0.05)。

表3 西門塔爾牛血清免疫指標測定結果 ng/L

2.3 西門塔爾牛血清酶活性測定結果慢性熱應激對西門塔爾牛血清酶活性影響的測定結果見表4。與非應激狀態相比，在熱應激狀態下，試驗牛血清中CK、LDH、ALT及AST含量顯著升高(P<0.05)，但AKP含量無顯著變化(P>0.05)。

表4 西門塔爾牛血清酶活性測定結果 U/L

3 討 論

3.1 慢性熱應激的判定及其對西門塔爾牛免疫功能影響奶牛在夏季高溫季節極易遭受熱應激侵襲，MADER等[3]研究發現，當環境溫度超過22℃時，奶牛即出現熱應激反應，徐明等[11]通過研究呼和浩特地區奶牛熱應激判定，也得出同樣結論。THI綜合環境溫度和相對濕度，常用于判定奶牛遭受熱應激程度。INGRAHAM等[14]報道當THI處于72～78時，奶牛處于輕度熱應激狀態；當THI為79～89時，奶牛將出現中度熱應激反應；當THI大于90時，將出現重度熱應激反應，極有可能導致奶牛死亡。奶牛活動最適宜的溫度范圍為-0.5～20.0℃，肉牛生長適宜溫度是5～25℃[15-16]。本試驗研究結果顯示，試驗后期草場平均溫度為22.82℃，CCI為20.37，沒有達到牛產生熱應激的臨界值，因此試驗牛在試驗后期處于非應激狀態；試驗前期牛舍內平均溫度為33.59℃，CCI達到29.61，已超出牛產生熱應激的臨界值，試驗牛處于熱應激狀態。

動物機體免疫系統由免疫器官、免疫分子和免疫細胞組成，免疫分子包括免疫球蛋白、白細胞介素、腫瘤壞死因子和干擾素等，機體可通過血液循環將免疫分子運送到全身，執行免疫防御和維持內環境穩定等功能。IL-2是T淋巴細胞受抗原刺激時分泌的淋巴因子；IL-1β、TNF-α和IL-4作為促炎癥因子，可導致炎癥反應，其濃度的升高和奶牛炎癥反應有極大的相關性，且前者可調節多種免疫系統反應[17-19]。免疫球蛋白是一類具有抗體活性的球蛋白，是動物機體內免疫系統的重要組成成分，IgA、IgG和IgM可在機體特異性免疫中發揮重要作用[20]。WU等[21]研究發現動物機體內免疫球蛋白含量的高低可能取決于應激強度、持續時間以及動物品種和體況。據研究發現，不同持續時間的熱應激均可導致山羊血清中IgA、IgG和IgM含量顯著降低，這表明在高溫環境下，山羊機體的免疫功能受到抑制，嚴重損害其體液免疫[22-23]。同樣熱應激可使肉牛血清中IgG含量顯著下降[24]。IgG是免疫球蛋白的主要成分，約占血清中免疫球蛋白總濃度的75%，其含量的高低可體現機體體液免疫的狀況[25]。CARROLL等[26]研究發現熱應激狀態下，安格斯牛血液中的TNF-α升高，熱應激可導致肉牛發生炎癥反應。PELI等[27]報道夏季熱應激后導致犢牛血清中IL-4含量由3.3 ng/L顯著上升到7.4 ng/L。本試驗研究發現，熱應激狀態下西門塔爾牛血清中IL-1β、IL-2和TNF-α含量顯著高于于非應激期，表明持續熱應激導致西門塔爾牛發生了炎癥反應。熱應激條件下西門塔爾牛血清中IgA和IgG含量顯著低于非應激期，表明西門塔爾牛在夏季遭受持續高溫刺激，導致其機體的免疫組織和功能遭到損害，體液免疫受到抑制。

3.2 慢性熱應激對西門塔爾牛血清酶活性的影響血清中的酶大部分來自機體的組織器官，酶是調節動物機體新陳代謝的催化劑，動物在健康生理狀況時，由于細胞膜的屏障作用，細胞內的酶不易逸出，當機體遭受應激導致細胞損傷時，細胞膜的通透性增加，細胞內的酶釋放進入血液，導致血清中酶含量增多，因此血清酶活性可作為判定動物組織器官健康狀況和應激反應程度的重要指標[28]。AKP廣泛的存在于動物體內的肝、胰等組織器官中；ALT和AST是機體氨基酸代謝過程中的兩種重要的轉移酶，主要存在于肝細胞和心肌細胞中，當細胞受損時會逸出到血液中；LDH主要存在于心肌細胞的胞質液中，當動物機體組織發生病變時，機體的糖代謝過程由有氧氧化轉化為無氧酵解時，血液中LDH活性增加[29]。CK主要存在于骨骼肌和心肌中，與機體內能量運轉和ATP再生有密切關系，且其含量的高低可反應應激對機體內組織細胞的損傷程度[30]。何欽[31]研究表明，在熱應激條件下，不同泌乳階段奶牛血清CK活性均出現不同程度的升高，且隨著熱應激程度的增加，各泌乳階段奶牛血清CK活性均有升高趨勢。劉慶華等[32]報道熱應激狀態下，荷斯坦奶牛和娟—荷奶牛血清中AKP、AST及ALT活性均顯著升高。但蔡明成[33]通過熱應激對肉牛血清酶活性研究，發現熱應激對肉牛血清AST和ALT活性無顯著影響，可能因為血清酶活性由多種途徑調控。本試驗研究發現，熱應激期間西門塔爾牛血清中CK、AST和ALT活性顯著高于非應激期，這表明高溫引起的熱應激對西門塔爾牛肝臟造成了一定的損傷，且對其組織細胞的供能造成了一定的影響。此外，熱應激導致西門塔爾牛血清中LDH活性顯著升高，可能某些組織器官已發生病變，機體能量代謝受到限制，但具體作用過程還需進一步探討研究。本試驗條件下，慢性熱應激可造成放牧西門塔爾母牛免疫功能下降，導致其患病風險升高。