不同濃度膽固醇對NEFA誘導的肝脂沉積的影響

趙瑩瑩，張冰冰，王 爽，麻芯茹，李 銘，郭 寒，徐 闖*，楊 威* (.黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 6339；.黑龍江八一農(nóng)墾大學 生命科學技術(shù)學院，黑龍江 大慶6339)

非酒精性脂肪肝疾病是危害人類乃至畜禽的重要疾病，高脂飲食以及能量負平衡下脂肪動員所致的高非酯化脂肪酸(NEFA)血癥是導致脂肪肝的主要病因。大量NEFA在肝臟會產(chǎn)生過量甘油三酯(TG)，而肝臟以極低密度脂蛋白(VLDL)的形式排除甘油三脂的能力不足最終導致肝脂蓄積，膽固醇(CHO)作為VLDL的重要組成部分，肝細胞內(nèi)CHO水平的變化對高NEFA所致的肝臟蓄積的影響特征尚不清晰。CHO是機體重要的營養(yǎng)物質(zhì)，它可促進脂肪運輸、參與細胞膜的形成、還是合成膽汁酸及類固醇激素的重要前體物，并對維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。體內(nèi)CHO主要來源于食物攝取和機體內(nèi)自身的生物合成，肝臟是其合成代謝的主要場所[1]。CHO主要在肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，NEFA的肝臟代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A是其合成的前體物，合成過程中需要ATP供能。肝臟中CHO以游離形式存在，部分游離CHO與活化的酰基輔酶A酯酰基結(jié)合形成CHO酯，膽固醇酯則以VLDL形式分泌到血漿；部分游離CHO也能通過轉(zhuǎn)化為膽汁酸，隨膽汁排出流入小腸[2]。研究指出能量負平衡下高濃度NEFA所致肝脂蓄積與CHO合成不足進而影響VLDL組裝有關(guān)[3-4]。肝臟CHO從頭合成需要大量ATP供能，而高NEFA介導的肝脂損傷對CHO的合成影響特征尚不清晰，且通過添加適量CHO能否緩解高NEFA介導的肝脂損傷尚待驗證。本試驗以大鼠肝細胞為研究對象，利用高NEFA刺激建立肝脂損傷模型，通過分析添加不同濃度CHO對NEFA導致的肝脂沉積影響特征，以明確CHO在非酒精性脂肪肝中的調(diào)控機制，為非酒精性脂肪肝致病機制及防控研究提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料大鼠肝細胞BRL-3A購自中國科學院細胞庫；胎牛血清購自CLACK公司；高糖DMEM干粉培養(yǎng)基購自Gibco公司；CHO、甲基-β環(huán)糊精(MβCD)購自Sigma；BSA購自BIOFROXX公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)均購自Roche公司；胰酶(0.25EDTA)、青鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol和NEFAs購自Sigma公司；TG試劑盒和總膽固醇(TC)試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；大鼠VLDL ELISA試劑盒購自朗頓公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Hochest核染購自碧云天公司；Bodipy493/503購自美國英杰生命技術(shù)有限公司。

1.2 CHO溶液的配制在細胞添加CHO溶液[5]，首先將干燥的CHO干粉加入無水乙醇中，在65°C溶解下，配成25 mmol/L CHO，然后將25 mmol/L CHO添加到甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)水溶液中，最終配制的CHO濃度為3 mmol/L，MβCD質(zhì)量濃度為44 g/L，于-20℃保存。

1.3 細胞處理大鼠肝細胞BRL-3A培養(yǎng)于6孔板，在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合劑的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,用無血清無雙抗培養(yǎng)基饑餓處理2 h后，將BRL-3A細胞在含2%BSA的高糖DMEM培養(yǎng)基中添加1.2 mmol/L NEFAs培養(yǎng)30 min后，分別添加10、30、60、100和150 μmol/L 的MβCD-CHO(MβCD-CHO)溶液刺激12 h后收集細胞。

1.4 TC和TG的測定收集細胞利用普利萊試劑盒檢測細胞中總TC和TG，具體步驟參考說明書。

1.5 大鼠VLDL含量檢測收集細胞上清用VLDL ELISA劑盒檢測，具體步驟參考說明書。

1.6 熒光定量RT-PCR法檢測脂合成指標SREBP-1C、ACC1和CHO合成相關(guān)指標SREBP-2c的mRNA表達水平，按照Trizol試劑說明書來提取細胞總RNA，測定核酸蛋白濃度后，取2 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA運用Roche SYBR GREEN染料法檢測SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c的mRNA表達水平。在NCBI上查找大鼠SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c和Tbp mRNA序列，利用Primer Premier 5軟件設計引物(表1)。QRT-PCR擴增體系(20 μL)：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，F(xiàn)orward Prime(10 μmol/L)1 μL，Reverse Prime(10 μmol/L)1 μL，DEPC水6 μL，cDNA 2 μL。反應條件均為：95℃ 3 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃，45 s；60℃ 15 s，40個循環(huán)。

表1 SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c和TBP PCR引物序列

1.7 Bodipy 493/503脂滴熒光染色將BRL-3A細胞接種于放置有細胞爬片的12孔細胞板中，每孔細胞約5 000個。試驗組加入1.2 mmol/L NEFA刺激30 min后，添加不同溶度MβCD-CHO溶液刺激12 h后，用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次后，隨后加入Bodipy 493/503染料進行避光染脂30 min，PBS避光清洗3次后，再避光加入Hoechst染料染核10 min，清洗3次后，甘油封片，激光共聚焦熒光顯微鏡上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CHO刺激對BRL-3A細胞內(nèi)TC含量的影響NEFA組細胞TC的含量低于對照組。NEFA+10 μmol/L CHO組TC含量與對照組無顯著差異。隨著CHO濃度的增大，細胞內(nèi)TC含量隨之增多，尤其當添加60、100和150 μmol/L CHO刺激時，細胞內(nèi)TC含量極顯著高于對照組和NEFA組(P<0.01)(圖1)。

*.與對照組相比差異顯著(P<0.05)；**.與對照組相比差異極顯著(P<0.01);#.與NEFA組相比差異顯著(P<0.05)；##.與NEFA組相比差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 不同濃度CHO刺激對BRL-3A細胞內(nèi)SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c mRNA表達的影響NEFA組的SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c mRNA表達含量均顯著高于對照組(P<0.05)(圖2)。圖2A、2B所示，NEFA+10 μmol/L CHO刺激時，細胞內(nèi)SREBP-1c、ACC1mRNA表達含量與對照組相比無顯著差異，但均顯著低于NEFA組(P<0.05)，而30、60、100和150 μmol/L CHO刺激組的SREBP-1c和ACC1的含量均顯著高于對照組和NEFA組(P<0.05)。如圖2C所示，10 μmol/L CHO刺激時，細胞內(nèi)SREBP-2c mRNA表達含量極顯著高于對照組相(P<0.01)，但與NEFA組無顯著差異，而30、60、100和150 μmol/L CHO刺激組的SREBP-2c mRNA表達含量均顯著低于對照組和NEFA組(P<0.05)。

圖2 不同處理組SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c mRNA相對表達水平

2.3 不同濃度CHO刺激對BRL-3A細胞TG含量和脂滴的影響NEFA組細胞內(nèi)TG和脂滴的含量顯著高于對照組(P<0.05)(圖3)。NEFA+10 μmol/L CHO組TG顯著低于NEFA組(P<0.05)，與對照組差異不顯著(圖3A)。隨著CHO濃度的增大，細胞內(nèi)TG含量與對照組相比有增高的趨勢，但無顯著差異，與NEFA組相比無差異。NEFA+150 μmol/L CHO組細胞TG含量極顯著高于對照組和NEFA組(P<0.01)。10 μmol/L CHO組的脂滴生成量顯著低于NEFA組，且隨CHO濃度增大，細胞脂滴的生成量均顯著高于對照組和NEFA組。尤其當添加100和150 μmol/L CHO刺激時，細胞內(nèi)脂滴含量極顯著高于對照組和NEFA組(P<0.01)(圖3B)。

圖3 各組TG含量(A)和脂滴生成量(B)

2.4 不同濃度CHO刺激對BRL-3A細胞上清VLDL含量的影響NEFA組細胞上清VLDL的含量顯著低于對照組(P<0.05)。NEFA+10 μmol/L CHO組VLDL含量顯著低于對照組，而顯著高于NEFA(P<0.05)。隨著CHO濃度的增大，細胞VLDL含量隨之降低，尤其當添加150 μmol/L CHO刺激時，VLDL含量極顯著低于對照組和NEFA組(P<0.01)(圖4)。

圖4 細胞上清極低密度脂蛋白的含量

3 討論

CHO是體內(nèi)比較豐富的固醇類化合物，其代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵器官是肝臟，肝臟能從頭合成或從所有各種血漿脂蛋白中獲取CHO[6]。同時肝臟中的CHO能通過合成膽固醇脂(CE)并以VLDL形式排出肝臟外[7]。當非酯化脂肪酸(NEFA)含量增高后，其脂肪組織的儲存能力和各組織對NFFA的氧化能力不足時，過多的NFFA通過激活非氧化通路以TG形式在非脂肪組織過度沉積，造成脂肪的沉積[8]。ANNA等[9]研究發(fā)現(xiàn)DGAT2反義寡核苷酸(ASO)(DGAT2-ASO)抑制TG的合成增加了肝臟游離脂肪酸(FFA)含量，誘導了微粒體FFA氧化酶Cyp2E1活性增強，表明TG的合成通過減少游離脂肪酸的積累以保護肝臟免受脂質(zhì)毒性。而VLDL是肝臟排出TG的主要途徑，VLDL的合成不足致使大量TG蓄積將導致嚴重的肝脂損傷。因此，肝臟中TG含量低可能反映肝臟游離脂肪酸暴露量低，對TG合成的需求降低[10]。

本試驗通過添加1.2 mmol/L NEFA刺激后，大鼠肝細胞呈現(xiàn)TG蓄積和脂肪變性等病變，且NEFA CHO水平低于對照組，表明NEFA組CHO水平低下與肝脂蓄積有重要相關(guān)性。添加不同濃度CHO刺激時，細胞內(nèi)CHO水平隨添加濃度升高而升高，通過結(jié)果可知，當10 μmol/L CHO刺激時，細胞內(nèi)TC含量與對照組無差異，而T含量顯著低于NEFA組(P<0.05)，但細胞上清中VLDL含量顯著高于NEFA組，并且細胞內(nèi)CHO合成相關(guān)指標SREBP-2c mRNA表達含量也高于NEFA組，表明添加10 μmol/L CHO能通過形成VLDL減輕高濃度NEFA造成的TG蓄積。并且由熒光定量和脂滴的結(jié)果顯示，10 μmol/L CHO能顯著降低細胞內(nèi)脂肪從頭合成相關(guān)基因SREBP-1c、ACC1的表達水平和脂滴含量，表明添加10 μmol/L CHO會減弱NEFA誘導的脂質(zhì)沉積。但隨著CHO濃度的增大，細胞內(nèi)TC和TG含量不斷增多，且細胞SREBP-1c、ACC1 mRNA表達含量和脂滴生成量與對照組相比顯著升高(P<0.05)。尤其是150 μmol/L CHO刺激時，細胞內(nèi)TG含量和脂滴生成量極顯著增多，而SREBP-2c mRNA表達水平和VLDL含量極顯著降低(P<0.01)，表明150 μmol/L CHO會進一步加重NEFA誘導的脂質(zhì)沉積。SREBP-1c、ACC1的水平與肝脂合成正相關(guān)，低水平CHO促進了肝細胞脂轉(zhuǎn)運，但高濃度NEFA和CHO刺激會引起細胞損傷及CHO穩(wěn)態(tài)失衡而造成脂質(zhì)毒性。高濃度CHO通過誘導胰島素誘導基因(INSIG)介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)SREBP裂解激活蛋白(SCAP)-SREBP-2復合體的保留而失活SREBP-2途徑，從而下調(diào)CHO的生物合成和攝取[11]。并且研究表明[12]，高脂+高膽固醇飲食飼喂的動物肝臟中CHO的積累會誘導線粒體損傷和呼吸鏈復合物蛋白質(zhì)的消耗。此外MARIA等[13]也證明肝臟中的CHO蓄積會導致線粒體變化，并可能使受損的肝細胞不斷增殖以抵抗細胞死亡，從而使肝臟永久受損。因此本試驗通過研究不同CHO濃度對NEFA誘導的脂質(zhì)沉積的影響，表明低濃度的CHO能減緩高NEFA所致的肝細胞脂質(zhì)沉積，為進一步治療肝脂沉積相關(guān)疾病提供一定理論基礎。