多表位流感納米粒構建表達及驗證

李 凱，于 潼，于成東，于 寧，莊忻雨，汪 偉，陳振海，田明堯*，金寧一* (1.揚州大學 獸醫學院，江蘇 揚州 5100；.軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所,吉林 長春 1301)

流感病毒是正黏病毒科的成員，正黏病毒科是一組包膜病毒，其中包含分段的負義單鏈RNA基因組。3種主要類型的流感病毒(A、B和C)感染人類，其中甲型和乙型流感病毒每年引起大量發病和死亡[1]。因此，具有廣譜抗流感的疫苗亟待研發[2]。

血凝素(HA)是流感的主要抗原，它在免疫過程中，誘導中和抗體的產生。雖然HA蛋白結構高度變異，但其第二亞基(HA2)形成相對保守的頸部結構域，在病毒感染早期階段起重要作用[3]。M2e是甲型流感病毒的跨膜區，自1993年以來，它的序列在人類分離物中幾乎沒有變化，并且與動物源性菌株進行對比，只有幾個氨基酸不同[4]。許多基于M2e候選疫苗產生特異性體液免疫以抵擋甲型流感的攻擊[5]，M2e和HA2結合的蛋白質疫苗是開發廣譜流感疫苗的一個有效途徑[6-7]。然而，M2e和HA2本身免疫原性就很差，刺激機體產生較少的多肽抗體[8]。這些抗原與高度免疫原性佐劑或蛋白載體融合可增強其免疫原性[8-9],最有希望提高免疫原性的是鐵蛋白納米顆粒，在抗原遞呈中起著至關重要的作用[10]。本試驗按照大腸桿菌偏愛密碼子對序列M2e-HA2-Ferrtin進行優化并合成，以pGH-T-M2e-HA2-Ferrtin為模板，擴增目的片段并克隆至原核表達載體pET32a，表達純化出流感多表位重組蛋白，為廣譜流感疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料T4DNA連接酶購自美國NEB公司；Mouse Anti-6X His tag?antibody和Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP)、His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)購自康為公司；克隆感受態細胞Trans1-T1、IPTG和表達感受態細胞BL21(DE3)與Blue Plus?Protein Marker均購自北京全式金公司；限制性內切酶與DNA Mark購自日本TaKaRa公司；原核表達載體pET32a由本室保存；引物和基因合成由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

1.2 引物設計與合成M2e和H1、H3、B亞型HA2保守區域通過4GSLinker與鐵蛋白連接，M2e-HA2-Ferrtin按照大腸桿菌密碼子優化由吉林省庫美生物科技有限公司合成并克隆至pGH-T載體上。利用Primer5.0設計1對特異性引物，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。引物PGH-pet-32a-MHF-F：GAATTCGATATTTGGACCTATA-ATGCAGAACT；pGH-pet32a-MHF-R：AAGCT-TGCTTTCATTATCACTATCACCTAAGG。下劃線部分為EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。

1.3 M2e-HA2-Ferrtin基因擴增、純化及酶切以合成的pGH-T-M2e-HA2-Ferrtin為模板擴增M2e-HA2-Ferrtin基因PCR體系(50 μL)：PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，加水補至50 μL。PCR反應程序：98℃預變性3 min；98℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸45 s，共33個循環；72℃下再延伸10 min，16℃ 30 min停止。取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果并拍照，剩余產物進行PCR純化，純化后經EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，酶切產物進行膠回收。置-20℃保存備用。

1.4 重組質粒的構建及酶切鑒定空載體pET32a熱轉化克隆感受態細胞Trans1-T1，涂布于含有氨芐青霉素(100 mg/L)的LB平板上培養12 h。挑取單個菌接于含氨芐青霉素的LB液體培養基擴培，提取質粒，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切。經1%瓊脂糖電泳后，切膠回收。回收的載體pET32a和目的片段M2e-HA2-Ferrtin過夜連接；熱轉化后，涂板。挑取單個菌于含氨芐青霉素的LB培養基擴培，提質粒，進行雙酶切鑒定并測序。測序由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

1.5 重組蛋白的誘導表達將構建的重組質粒熱轉化表達感受態細胞BL21(DE3)，重組菌涂于含氨芐青霉素的LB平板。挑取單個菌落于5 mL含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養基，37℃、220 r/min，過夜培養。取培養的菌液接2YT(含氨芐抗生素)培養基中于搖床培養，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 20 μL,220 r/min、37℃、8 h。誘導菌液經12 000 r/min、4℃離心6 min，棄上清，用預冷PBS重懸菌體，離心。將沉淀重懸于PBS中，于冰上超聲破碎。樣品煮沸后進行SDS-PAGE 檢測。

1.6 重組蛋白純化條件摸索將含有目的蛋白的溶液，取上清過平衡的層析柱，用20、50、100、200、300、500 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫。收集洗脫液。經SDS-PAGE檢測純化效果。

1.7 Western blot 檢測重組蛋白免疫學活性蛋白經SDS-PAGE后轉膜，用5%脫脂乳封閉1 h；分別加入鼠源His單抗作為一抗，過夜孵育，用TBST洗3次，10 min/次。加入羊抗鼠IgG-HRP(二抗)，室溫孵育1 h，洗滌后，均勻滴加ECL顯色液進行顯色并拍照。

1.8 重組蛋白透射電鏡觀察取50 μL蛋白樣與透射電鏡專用銅網共孵育5 min，1%磷鎢酸負染3 min，濾紙吸去多余染液，通過(透射電子顯微鏡transmission electron microscope，TEM)觀察蛋白結構。重復樣品3次，避免試驗誤差。

1.9 重組蛋白納米粒度儀分析打開納米粒度儀，預熱20 min左右，比色皿中加入3 mL的去離子水，取20 μL樣品加入四面光滑的比色皿中,進行樣品測試。

2 結果

2.1 pET32a-M2e-HA2-Ferrtin原核表達載體的構建EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組質粒pET32a-rHF可見1 071 bp大小的M2e-HA2-Ferrtin(圖1)和5 900 bp載體片段(圖2)。

M.DL5000 DNA Marker;1.MHF基因擴增產物

M.DL5000 DNA Marker;1.重組質粒pET-32a-MHF;2.EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切重組質粒

2.2 重組流感蛋白的表達純化設置對照組空載體pET32a，重組流感蛋白組進行蛋白誘導，流感蛋白主要以可溶形式存在，相對分子質量約61 kDa(圖3)，蛋白純化后蛋白純度可達80%(圖4)。

M.蛋白Marker;1.pET32a空載體全菌;2.pET32a空載體超聲破碎沉淀;3.pET32a空載體超聲破碎上清;4.pET32a-MHF全菌;5.pET32a-MHF超聲破碎沉淀;6.pET32a-MHF超聲破碎上清

M.蛋白Marker;1.20 mmol/L咪唑;2.50 mmol/L咪唑;3.100 mmol/L咪唑;4.200 mmol/L咪唑;5.300 mmol/L咪唑;6.400 mmol/L咪唑;7.500 mmol/L咪唑

2.3 重組蛋白純化條件摸索為了最大化的去除雜蛋白，通過20、50、100、200、300、500 mmol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫目的蛋白。最終成功確定20 mmol/L 咪唑洗滌，300 mmol/L洗脫目的蛋白(圖5)。

M.蛋白Marker;1.純化的pET32a-MHF;2.未純化的pET32a-MHF

2.4 重組蛋白免疫學活性以重組蛋白為抗原，分別以Antibody-his mouse 為一抗。HRP羊抗鼠IgG為二抗進行Western blot。在61 kDa出現目的條帶(圖6)。與預期結果一致，表明重組流感蛋白具有生物學活性。

M.蛋白Marker;1.pET-32a-MHF重組蛋白與相應抗體反應條帶;2.pET-32a空載體對照

2.5 重組蛋白納米電鏡分析通過電子透射顯微鏡觀察重組流感蛋白，呈現類病毒樣顆粒的結構(圖7)，大小均一，20～70 nm占78%以上。

圖7 透射電子顯微鏡下重組流感蛋白

2.6 納米粒度儀分析納米粒大小通過納米粒度儀分析重組蛋白粒徑大小(圖8)，大部分流感納米粒徑分布為12～67 nm，平均粒徑61.58 nm。

圖8 納米粒度儀分析重組蛋白納米粒大小

3 討論

流感病毒血清型眾多，抗原易突變，能夠感染人和動物。每年都有許多人死于季節性流感[11]。據世界衛生組織統計，全球流感患病人數高達10億，其中有300萬～500萬比較嚴重的病例，每年死亡人數高達30萬～50萬。近年來，流感病毒的跨種傳播成為新的變異趨勢[12]。

半個多世紀以來，針對各種流感病毒引起廣泛交叉保護的流感疫苗一直是一項科學挑戰[11]。針對流感蛋白中保守的表位以產生特異性免疫，只要適當呈現這些表位，如保守的HA莖區域和M2e就有可能發展成為通用流感疫苗[12-13]。蛋白質外殼結構，例如病毒衣殼和鐵蛋白，是適用于遺傳和化學修飾的多功能納米級平臺[14]。通過多功能納米級平臺來提高抗原的免疫原性是一種有效的方法[15]。因此，基于Ferrtin基因共表達流感的保守序列的蛋白對流感病毒的防治具有重大意義。

本研究通過大腸桿菌系統成功表達基于鐵蛋白的重組流感融合蛋白，通過鎳柱純化及摸索蛋白洗滌、洗脫濃度，成功純化出目的蛋白，蛋白以可溶性形式存在，純度高達80%,納米粒度儀表明平均粒徑61.58 nm。通過透射電子顯微鏡觀察，可以看到類似于病毒樣顆粒的結構，大大提高了抗原性。為廣譜流感亞單位疫苗的研發奠定理論基礎。