敲除Rbpj降低小鼠子宮蛻膜對孕酮的敏感性

謝 娟，康勁文，劉曉征，顏婉錕，蘇仁偉 (華南農業大學 獸醫學院，廣東 廣州 510642)

哺乳動物通過妊娠為發育期的胎兒提供穩定環境以保護胎兒的生長。孕酮(progesterone,P4)是維持雌性哺乳動物妊娠最重要的甾類激素之一，在妊娠早期，維持妊娠所需的P4幾乎全部由卵巢黃體分泌，而妊娠后期P4的主要來源則為發育完成的胎盤[1]。P4通過多種途徑執行其維持妊娠的功能，包括促進子宮內膜基質細胞的蛻膜化、將子宮內膜轉化為接受態以接受胚胎的著床、抑制母體免疫系統對胎兒的免疫排斥以及抑制子宮肌層的收縮等[2]。蛻膜化是指子宮基質細胞由成纖維狀分化為上皮樣并成為具有分泌功能的蛻膜細胞的過程，是妊娠的成功建立所必須。蛻膜細胞可為著床后的胚胎發育提供營養物質，調節胚胎滋養層細胞的侵入和胎盤形成，蛻膜還可保護胎兒免受母體產生的免疫反應的侵害。不同程度的蛻膜化受損都會導致胚胎著床失敗、早期妊娠丟失、流產或早產[3]。

重組信號結合蛋白Jκ(recombination signal binding protein Jκ,Rbp-Jκ,由Rbpj基因編碼)是Notch信號通路的核心轉錄因子。哺乳動物的Notch信號通路由Notch1～4四個受體、Delta-like1,3,4和Jagged1,2五個配體以及核心轉錄因子Rbp-Jκ和其他共激活因子組成[4]。當與相鄰細胞的配體蛋白結合后，Notch受體接受2次切割后釋放其C端裂解產物胞質內結構域(intracellular domain,ICD)，該片段是Notch的活性形式，被釋放后能夠立即轉位到核內與轉錄因子Rbp-Jκ結合并將其轉換為轉錄激活因子，從而啟動下游靶基因的轉錄和表達[5]。Notch信號通路在雌性哺乳動物妊娠過程中起著重要作用，在小鼠妊娠前期的子宮基質細胞蛻膜化過程中，Notch1受體表達增加，抑制Notch信號通路會使蛻膜反應受到影響，并誘導凋亡相關基因的表達[6]。除此之外，Notch信號通路還與P4相互調節，小鼠子宮中Notch1信號的異常激活導致P4受體(progesterone receptor,Pgr)的基因啟動子區域甲基化程度增加并引起Pgr表達的降低和不孕[7]。在人子宮內膜異位癥病人的異位子宮內膜中，Notch1的異常高表達與PGR表達量的降低具有相關性，可能導致內異癥婦女的子宮內膜對P4處理的抵抗[8]。

Rbpj在小鼠胚胎著床和蛻膜化過程中也具有重要的作用，子宮特異性敲除Rbpj會導致著床、妊娠和產后修復異常，而特異性敲除滋養層細胞中的Rbpj則會導致絨毛膜尿囊形態發生異常和滋養層細胞分化不良[9-11]。本研究使用子宮特異性敲除Rbpj基因小鼠，結合人工誘導蛻膜化模型試驗，探討Rbpj影響雌性生殖的機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物將Pgr啟動子驅動Cre酶表達的PgrCre/+小鼠(由貝勒醫學院贈予)與在Rbpj基因21～23外顯子兩側添加了Flox位點的RbpjF/F小鼠(由東京大學贈予)雜交，獲得子宮特異性敲除Rpbj的PgrCre/+RbpjF/F(簡寫為Rbpjd/d)或作為對照的Pgr+/+RbpjF/F(簡寫為Rbpjf/f小鼠。所有小鼠均在華南農業大學實驗動物中心SPF級動物房中飼養，自由取食飲水，光照(7:00至19:00)和黑暗(19:00至次日7:00)各12 h，室內溫度維持在22～24℃，相對濕度維持在60%～70%。

1.2 緩釋管的制作與孵育參考COHEN等[12]所述，并在此基礎上修改制備P4緩釋管。緩釋管由1.5和2.5 cm 2種不同長度的硅橡膠管(內徑1.57 mm，外徑3.18 mm,Dow Corning,Midland,MI,USA)制備。該硅膠管的管壁上有細小空隙，可以維持釋放管中的藥物穩定。內套管為普通聚乙烯管(兩端共插入0.5 cm)。每個緩釋管的有效長度，即兩端聚乙烯管之間的長度為有效釋放長度，為1或2 cm。稱取一定量的P4(Sigma)到芝麻油中配成P4質量濃度為250或500 g/L的白色油-P4混懸液。用1 mL注射器吸取混勻后的混懸液，通過一端的聚乙烯管注入硅膠管中，直到填充整個長度的硅橡膠和聚乙烯管且無氣泡，將從硅橡膠管兩端突出的聚乙烯末端熱密封、備用。使用前將緩釋管在90%乙醇中清洗干凈，再用蒸餾水清洗，在37℃,1% FBS(1×PBS配制，pH 7.35)中孵育過夜(≥16 h)；小鼠麻醉后，緩釋管埋植入背部皮下。

1.3 人工誘導蛻膜化蛻膜化模型參考FIONA等[13]方法并稍作修改，如圖1所示。將成年的Rbpjd/d雌性小鼠和Rbpjf/f雌性小鼠于6～7周齡切除兩側卵巢后繼續飼養2周，以清除體內殘余激素。第1～3天每天上午9:00皮下注射0.1 mL的雌二醇(17β-estradiol,E2,Sigma,100 μg/0.1 L)，第6天上午8:30將小鼠麻醉后在背部皮下埋植緩釋管，之后連續3 d進行皮下注射0.1 mL的E2(6.7 μg/0.1 L)。第8天下午15:00(當天注E2之后6 h)進行單側子宮人工誘導蛻膜化手術，從小鼠背部一側開口(非緩釋管埋植側)，暴露子宮角，使用7號注射針頭在系膜對側刮擦6～8次，縫合肌肉層和皮膚的手術創口；另一側作為對照。于術后72或120 h將小鼠麻醉，采集血液，再將小鼠經頸椎脫臼處死，取出子宮，拍照并取材固定。

圖1 人工誘導蛻膜化模型示意圖

1.4 基因型鑒定剪尾于小鼠出生后的第21～23天進行(PND21～23)。記錄小鼠出生信息，給小鼠打上耳標，剪掉5～10 mm的鼠尾組織，保存用于基因型鑒定。

用鼠尾溶解液(tail dissolve buffer,TDB)溶解鼠尾組織。TDB配制方法如下：KCl 0.745 5 g,Tris 0.242 3 g,Triton-X100 200 μL,dH2O定容至200 mL(pH調至9.0)。按每根鼠尾100 μL TDB配置裂解體系，體系中加入2 μL、20 g/L的蛋白酶K，終質量濃度為0.4 g/L。恒溫振蕩儀60℃振蕩加熱3 h，轉為94℃，15 min后停止；將混懸液室溫13 000 r/min 離心5 min，取上清液(鼠尾DNA樣品)轉入新的離心管中，-20℃保存備用,提取DNA,基因型鑒定 PCR引物見表1。

表1 基因型鑒定PCR引物序列

1.5 HE染色與免疫組織化學小鼠頸椎脫臼法處死后收集子宮，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度5 μm。切片經脫蠟復水后進行常規的HE染色。免疫組化脫蠟復水步驟同HE染色，后對切片進行抗原修復，10%馬血清封閉后與Rbpj抗體(1∶100)孵育過夜，再進行二抗孵育和DAB染色，脫水封片。

1.6 血清P4濃度的檢測小鼠麻醉、眼球采血，4℃過夜后離心取上層血清，分裝在離心管中并標記小鼠信息，-80℃儲存，血清樣本P4濃度由上海研輝生物科技有限公司測定。

2 結果

2.1 確認小鼠子宮中Rbpj的敲除成功

2.1.1基因型鑒定 以4只小鼠的鑒定結果為例，PgrCre/+和Rbpj基因型鑒定結果如圖2所示，在PgrCre/+基因型PCR鑒定中，只擴增出WT(302 bp)條帶而無Cre(522 bp)條帶的為基因型Pgr+/+(A0462和A0495)，同時含有Cre條帶和WT條帶的基因型為PgrCre/+(A0508和A0512)。在Rbpj基因型的擴增結果中顯示，4只鼠都擴增出Rbpj-Flox條帶(600 bp)，而無Rbpj-WT條帶(500 bp)，證實這些小鼠的基因型均為RbpjF/F。綜上所述，A0462和A0495的基因型為Pgr+/+RbpjF/F(Rbpjf/f)，作為對照組；其余的基因型為PgrCre/+RbpjF/F(Rbpjd/d)，為子宮特異性敲除Rbpj小鼠，將其作為試驗組。

A.PgrCre/+小鼠的基因型鑒定；B.RbpjF/F小鼠的基因型鑒定 M.DL1000 DNA Marker;1.A0462;2.A0495;3.A0508;4.A0512;5.陰性對照

2.1.2Rbpj轉錄因子在敲除鼠子宮中表達量降低 將確認過基因型的雌性小鼠與已知可育的雄性小鼠合籠，以見到陰道栓為妊娠第1天。免疫組織化學結果如圖3所示，在妊娠第8天的子宮中，相比于Rbpjf/f小鼠，Rbpjd/d小鼠Rbp-Jκ的蛋白水平表達量在胚胎周圍的基質中明顯降低，證明子宮特異性敲除Rbpj成功。

A.Rbpjf/f小鼠子宮；B.Rbpjd/d小鼠子宮(500 μm)

2.2 子宮特異性敲除Rbpj小鼠對P4敏感性的影響首先測試能夠維持野生型小鼠蛻膜化所需的正常P4劑量下Rbpjd/d小鼠對人工誘導蛻膜化的響應能力。結果表明，在此劑量下(1 cm+250 g/L P4)，雖然對照組Rbpjf/f小鼠的子宮可以正常響應人工誘導蛻膜化刺激(圖4A)，但Rbpjd/d小鼠子宮在術后120 h已無法維持蛻膜化狀態(圖4B)。Rbpjd/d小鼠的蛻膜側子宮相較Rbpjf/f小鼠的同側子宮細且顏色更深；HE染色結果顯示，Rbpjf/f小鼠蛻膜仍然完整，而Rbpjd/d小鼠的蛻膜組織已經開始脫落，脫落組織剝落進子宮腔中，壞死伴有出血現象(圖4)。術后72 h的蛻膜化情況如圖5A所示，在1 cm+250 g/L P4劑量組，與對照側子宮角相比，Rbpjf/f小鼠蛻膜側子宮角體積腫大且充血呈粉紅色；相比之下，Rbpjd/d小鼠蛻膜側子宮角體積明顯小于對照組，且有部分敲除鼠未成功蛻膜化。對蛻膜側/對照側子宮角的重量比分析發現，Rbpjd/d小鼠的蛻膜化程度顯著小于Rbpjf/f小鼠(圖5A)。HE染色顯示Rbpjf/f小鼠子宮的蛻膜明顯大于敲除鼠的子宮蛻膜；在Rbpjf/f小鼠子宮中，被蛻膜化組織包裹的上皮部分完整呈柱狀(圖5C)。而在敲除鼠中，系膜側附近的子宮基質細胞有較大部分并沒有發生蛻膜化，腔上皮完整，這可能是造成子宮體積偏小的原因之一(圖5C)。此外，與Rbpjf/f小鼠(n=106)對人工誘導蛻膜化刺激100%的響應率相比，Rbpjd/d小鼠(n=100)的蛻膜化響應率僅為88%，低于對照組的成功率(圖5B)。

2.3 高劑量P4可以部分挽救Rbpj敲除導致的蛻膜化能力下降為了測試高劑量的P4是否可以挽救Rbpj敲除導致的蛻膜化能力下降，將試驗所用P4質量濃度提高為500 g/L，并且將緩釋管的有效長度提高為2 cm(2 cm+500 g/L P4)。結果顯示，在人工誘導蛻膜化術后72 h，Rbpjd/d小鼠的蛻膜化程度和蛻膜重量仍然顯著低于Rbpjf/f小鼠(圖5F～G)。但是，在提高P4劑量后，2種基因型小鼠蛻膜重量之間的差異明顯變小(圖5E,H)。在術后120 h，與Rbpjf/f小鼠相比，Rbpjd/d小鼠子宮的蛻膜化程度仍較低，且出現大面積壞死和出血，與基底層界限清晰，僅在系膜側可見小部分形態完整的蛻膜化細胞，表明中心蛻膜組織即將從邊緣脫落(圖5C,D)。但與低劑量P4組相比，高劑量P4組Rbpjd/d小鼠子宮蛻膜化程度已有明顯改善(圖4B,D)。無論是低劑量還是高劑量P4組，緩釋管在試驗結束取出時仍存有大量P4的殘余，證明Rbpjd/d小鼠蛻膜化的維持與P4的總量無關，而與緩釋管的有效長度有關，隨單位時間內釋放的P4量增大，更有助于敲除鼠蛻膜化的維持。

A,B.1 cm+250 g/L P4條件下的子宮；C,D.2 cm+500 g/L P4條件下的子宮;A,C.Rbpjf/f小鼠;B,D.Rbpjd/d小鼠；(100 μm)

A,C,D,E.1 cm+250 g/L P4條件下子宮；F～H.2 cm+500 g/L P4條件下子宮；C,F.Rbpjf/f小鼠；D,G.Rbpjd/d小鼠；(100 μm)；B.蛻膜化成功率

2.3.1不同P4劑量和基因型對蛻膜側與對照側子宮重量比的影響 進一步對所有試驗組和對照組小鼠兩側子宮角的質量比進行分析，發現在術后120(圖6A)和72 h(圖6B)，相同劑量P4下Rbpjd/d小鼠與Rbpjf/f小鼠相比，子宮重量比都有顯著降低。然而，不同劑量P4組中的Rbpjf/f小鼠子宮質量比值無明顯差異，但Rbpjd/d小鼠在術后120 h時在高劑量P4組的蛻膜程度顯著高于低劑量組(圖6A)(P<0.05)。在500 g/L P4中，敲除鼠(2 cm緩釋管)和對照鼠(1 cm緩釋管)的蛻膜化程度較接近(圖6C)，進一步證明敲除鼠對P4的依賴性更強，高劑量的P4可以挽救因Rbpj敲除導致的蛻膜化程度降低。

A.術后120 h；B.術后72 h；C.500 g/L P4，不同長度緩釋管，術后72 h

2.3.2Rbpjd/d小鼠對P4的消耗量 對小鼠血清中的P4質量濃度進行檢測后發現，2 cm+500 g/L P4在術后120 h時，敲除鼠血清中的P4質量濃度顯著低于對照鼠血清中的質量濃度(圖7)，這表明Rbpj敲除鼠可能對P4需求更大。

圖7 血清中P4濃度

3 討論

3.1Rbpj敲除小鼠對蛻膜化的反應能力下降經典的Notch信號通路通過其核心轉錄因子Rbpj激活下游靶基因來介導重要的細胞分化和個體發育功能，包括器官的自我更新[14]。全身性Rbpj缺失會導致妊娠早期胚胎致死，而子宮特異性敲除Rbpj小鼠則因胚胎著床角度異常而導致妊娠的丟失[9,15]。此外，子宮特異性敲除Rbpj小鼠的子宮內膜產后修復能力受到顯著影響，從而導致繼發性不孕[10]。

有研究表明，Rbpj敲除小鼠的子宮對人工誘導蛻膜化的響應能力下降，但該研究采用皮下注射方式給予P4，不能精確的控制不同小鼠間單位時間內釋放到血液中的P4劑量[16]。本研究中使用緩釋管方式，通過控制有效長度精確地控制單位時間內釋放到血液中的P4劑量，使其在不同小鼠之間盡量保持一致，同時也能保證P4穩定釋放，避免皮下注射P4帶來的血清P4濃度的劇烈波動。研究結果表明，在相同P4劑量下，無論是高劑量還是低劑量P4組，Rbpj敲除小鼠的子宮對人工誘導蛻膜化的響應能力都顯著低于對照組小鼠，與上述的研究結果一致。本研究的每種基因型小鼠的樣品數量超過100只，結果更接近真實情況。本研究還進一步發現敲除小鼠蛻膜化能力受損的原因是系膜對側部分基質細胞未能成功發生蛻膜化。

3.2Rbpj敲除影響小鼠P4受體表達和對P4的利用P4對子宮內膜蛻膜化的建立和維持至關重要，P4受體Pgr及P4靶基因如Ihh和Hoxa10等敲除小鼠均表現為蛻膜化能力的喪失或下降[17-18]。在妊娠早期，卵巢黃體是P4的主要來源。而將黃體與Notch信號通路抑制劑DAPT一起孵育時，P4合成量減少，表明Notch信號通路對P4的合成至關重要[20]。此外，在子宮中過度激活Notch信號通路還會導致P4受體Pgr的下調，說明Notch信號通路還可以通過調節Pgr的表達影響P4信號通路的活性[8]。人子宮成纖維細胞的體外試驗研究中證實，P4處理能夠促進Notch1受體蛋白胞質內區的剪切，從而誘導其活性形式N1ICD的上調[21]。諸多研究表明，無論是在卵巢還是子宮中，Notch信號通路與P4以及P4受體之間存在一定的聯系，在哺乳動物的蛻膜化和妊娠過程中相互調節。

在先前的研究中，Rbpj敲除小鼠蛻膜中P4受體Pgr的表達量下調，這很可能是敲除小鼠在相同劑量的P4作用下蛻膜化能力下降的原因之一[16]。除此之外，研究結果還表明，在給予同樣劑量和有效長度的P4緩釋管的情況下，Rbpj敲除小鼠的血清P4濃度顯著低于對照小鼠，表明作為P4的重要靶器官，子宮內膜中的Rbp-Jκ對于P4的代謝也有一定的影響。但是，該影響的具體作用機制還需要進一步的探索。

3.3 高劑量P4可部分挽救Rbpj敲除導致的蛻膜化能力下降研究表明，P4的劑量對子宮內膜蛻膜化的維持至關重要，在不同P4水平下，子宮蛻膜崩解出血的時間隨P4水平的升高而延遲[22]。本研究中的緩釋管給藥法保證單位時間內釋放到小鼠體內的P4水平與緩釋管的有效長度呈線性正相關，并證明低劑量的P4對于對照組子宮內膜的蛻膜化維持已經足夠，但是在敲除鼠中子宮內膜蛻膜化無法維持到120 h。而提高P4劑量則可以有效的緩解因Rbpj敲除引起的蛻膜化損傷和維持障礙。但是在高劑量P4組，敲除小鼠子宮內膜的蛻膜化程度依然低于對照組小鼠。這些研究結果表明，提高P4劑量可以部分挽救因缺失Rbp-Jκ造成的小鼠子宮內膜對人工誘導蛻膜化能力降低，但不能完全挽救。進一步分析表明，雖然無論使用1還是2 cm的緩釋管，在相同P4劑量下敲除小鼠的蛻膜化反應程度都顯著低于對照小鼠，但敲除小鼠在高劑量P4情況下的蛻膜化程度與對照小鼠在低劑量P4情況下的較為接近，進一步證明相對于對照小鼠，敲除小鼠蛻膜對P4的依賴性更強，但敏感性更低。

綜上所述，Notch信號通路核心轉錄因子Rbpj缺失會導致小鼠的蛻膜化能力下降，蛻膜子宮對P4的敏感性降低且具有劑量依賴性，可以通過提高P4劑量的方式加以部分挽救。其詳細調節機制有待于進一步的研究和探索。