兔原始生殖細胞(PGCs)體外培養和生物學特性

丁雪粉,張德芳，呂海淼,彭 展,閆琛博,楊德新,王新莊* (.河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450000；.河南省科技信息研究院，河南 鄭州 450000)

在體外特定的培養條件下，兔原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)可以重編程為生殖干細胞(embryonic germ cells,EGCs)，EGCs具有和胚胎干細胞(embryonic stem,ES)相似的生物學特性，為再生醫學的研究提供合適的種子細胞[1]。在體外，培養液中加入特定的誘導因子，PGCs可以定向分化為成熟的生殖細胞，這方面的研究在生殖生物學上有著舉足輕重的地位[2]。PGCs在體外培養過程中很容易發生凋亡和分化，因此需要對PGCs的體外培養條件進行探索和優化，以促進PGCs轉分化為EGCs，并阻止其分化和凋亡。有很多學者探索PGCs的體外培養條件，這對大規模培養PGCs非常有意義。本研究以胎兔為研究對象，比較了胎齡、血清(fetal bovine serum,FBS)、血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、維甲酸(retinoic acid，RA)、福司柯林(forskolin，FK)和三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen，4OHT)等因素對PGCs分離培養的影響，并探究其生物學特性，完善兔PGCs體外分離培養條件，為下一步的建系工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6月齡以上日本大耳白兔購自河南省實驗動物中心。

1.2 主要試劑H-DMEM干粉培養基、胎牛血清、雙抗、非必需氨基酸(NEAA)和Knockout-DMEM購自Gibco公司；FK、4OHT、RA和轉鐵蛋白和白血病抑制因子(LIF)購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、DNA Maker等購自TaKaRa公司。

1.3 PGCs基礎培養液的配制PGCs基礎培養液的配制方法詳見表1。

表1 PGCs基礎培養液的配制

1.4 不同成份PGCs培養液的配置基礎培養液標記為A培養液；在A中加入3 μmol/L RA，記為B培養液；在A中加入100 nmol/L 4OHT，記為C培養液；在A中加入20 μmol/L FK，記為D培養液；在A中加入3 μmol/L RA和20 μmol/L FK，記為E培養液；在A中加入3 μmol/L RA和100 nmol/L 4OHT，記為F培養液；在A中加入100 nmol/L 4OHT和20 μmol/L FK，記為G培養液；在A中同時加入100 nmol/L 4OHT、20 μmol/L FK和3 μmol/L RA，記為H培養液。

1.5 不同胎齡兔PGCs分離培養分別取妊娠E10.5、E11.5、E12.5、E13.5、E14.5和E15.5的孕兔子宮，分離生殖嵴。以24孔板每孔接種2個生殖嵴密度為宜。24 h進行第1次換液，之后隔天換液。

1.6 胎齡對PGCs體外培養的影響從不同胎齡的兔生殖嵴中分離PGCs，加入含有15% KSR的基礎培養液。每個胎齡重復接種3次，取3次的平均值記為當天的集落數量。每天在顯微鏡下觀察細胞生長狀態，記錄形成集落數量，細胞集落數量為縱坐標，時間為橫坐標，用Graphpad Prism 7制作細胞生長曲線圖。

1.9 兔PGCs的傳代培養原代PGCs在體外培養7～10 d，對其進行傳代培養，玻璃細針小心挑出集落，離心重懸后接種到新制備的飼養層上。

1.10 分化能力檢測PGCs體外培養形成集落后，用玻璃細針小心地挑出集落，轉移到含有2 mL消化液的離心管中。離心后用不含LIF的基礎液A(加入15% KSR)，去除飼養層，接種在96孔板上。

1.11 兔PGCs多能性的鑒定

1.11.1形態學觀察 PGCs接種之后，每24 h在顯微鏡下觀察PGCs的狀態并拍照。

1.11.2堿性磷酸酶(AKP)染色 按照AKP染色試劑盒的說明書進行操作，以飼養層細胞為陰性對照，染色后PGCs集落中的AKP呈紅黑色，為陽性;無色或淺紅色則為陰性。

1.11.3RT-PCR檢測 引物由尚亞生物技術公司合成(表2)。收取未分化的集落，提取RNA，反轉錄為cDNA后進行DNA凝膠電泳。PCR 20 μL反應體系為：PrimeScript RT Enzyme Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，dd H2O 7 μL。PCR反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s(40個循環);60℃ 30 s。

表2 PCR擴增引物

2 結果

2.1 兔PGCs生長行為觀察在倒置顯微鏡下，兔PGCs表現出相互吸附、聚集和遷移的生物學特征，呈條索狀(圖1A)。隨后PGCs繼續遷移及增殖，鋪滿24孔板底部。呈現1個較大集落，似ES形態，有1個大的半透明核，1個突出的單個核仁，相對較少的細胞質，PGCs聚集成島嶼狀或巢狀，集落中細胞之間排列致密，界線不清，表面光滑，但集落邊緣清晰，立體感強(圖1B)。PGCs遷移過程中，也會有空泡狀的集落出來(圖1C)，同時進行大量的增殖(圖1D)。

2.2 傳代后的PGCs傳代之后單個PGCs仍可以聚集形成集落，但是傳代后的集落形態沒有原代立體。第1次傳代后PGCs遷移聚集成集落樣生長的能力較強，細胞活性較好(圖2A)；第2次傳代后PGCs仍可以聚集成集落樣生長，但細胞的活力有所降低，有很多單細胞沒有聚集成明顯的集落(圖2B)。這表明隨著傳代次數的增加，細胞活力會逐漸降低。本試驗只進行了2次傳代。

A.第1次傳代后的PGCs；B.第2次傳代后的PGCs(40×)

2.3 兔PGCs多能性鑒定將集落進行AKP染色，為紅黑色，呈陽性，集落內的細胞展現出很高的AKP活性，飼養層不著色(圖3A)，這是多能性細胞的標志。PGCs可以自發分化為成纖維樣、上皮樣、神經樣等細胞(圖3B、C)。形成的PGCs克隆(EGCs)，消化為單細胞懸液，撤去LIF和飼養層后，培養5 d可形成擬胚體(圖3D)。擬胚體在顯微鏡下觀察呈球狀。這也表明PGCs在體外特定的培養條件下可以重編程為具有多能性EGCs，多能性OCT-4基因呈陽性表達(圖4)。

A.AKP染色呈陽性；B.PGCs分化為神經樣細胞；C.PGCs分化為上皮樣細胞(40×)；D.擬胚體

M.DL2000 DNA Marker；1.GAPDH；2.陰性對照；3.OCT-4

2.4 胎齡對PGCs體外培養的影響E10.5和E11.5的PGCs集落數基本一致，生長曲線也基本一致。E12.5的PGCs集落數大于E13.5的PGCs集落數。E14.5和E15.5的PGCs集落數基本一致。E10.5和E11.5的PGCs集落數要明顯大于E12.5、E13.5、E14.5和E15.5。PGCs形成的集落數隨胎齡的增加依次減少(圖5)。

圖5 不同胎齡的PGCs生長曲線圖

2.5 RA、FK、4OHT對PGCs體外培養的影響E10.5、E13.5和E15.5的PGCs在不同培養液中培養，24 h后均沒有集落形成，72 h后均出現集落。H組培養液中的集落數量相對于其他組數量較多(表3～5)。E15.5的PGCs增殖緩慢，只有很少的集落形成。相對于E13.5和E15.5的PGCs，E10.5的PGCs在同樣培養液中的集落數量較多，尤其在H組培養液中的集落數量較多。

表3 E10.5胎兔PGCs集落個數

2.6 有無血清對兔PGCs體外培養的影響在15% FBS組中，以A組培養液集落數量為對照，其中E、F、G和H的培養液集落數量均顯著多于A組，H組培養液中的集落數量較多；在15% KSR組中，以A組培養液集落數量為對照，其中E、F、G和H的培養液集落數量均顯著多于A組，H組培養液中的集落數量較多。且含15% KSR培養液中的集落數量均多于含15% FBS培養液中的集落數量(圖6)。

表4 E13.5胎兔PGCs集落個數

表5 E15.5胎兔PGCs集落個數

A～F.A～F組培養液

3 討論

3.1 體外培養過程中PGCs的生物學特性本研究發現PGCs在體外培養過程成中會相互吸附、遷移、聚集成集落狀，最后形成EGCs集落。EGCs可以分化為神經樣細胞、上皮樣細胞和擬胚體。PGCs遷移過程中有空泡狀的集落出現，馬倩等[3]在研究豬PGCs生物學特性中發現，試驗初期原代PGCs有大量“出芽”或“發泡”狀的細胞。有學者在研究爪蟾胚胎24期時發現，PGCs會呈現小的泡狀結構，隨著胚胎的發育，泡狀結構也在變大，細胞伸展變得更加細長，此時PGCs的活性很高[4]。也有研究表明，PGCs泡狀結構的出現可能與細胞的遷移行為有關，如變形蟲等。當變形蟲移動時，它的前端會出現一個氣泡，推動作用的產生依賴于肌動球蛋白收縮[5]。纖維狀肌動蛋白出現在拉伸的爪蟾PGCs的后半段[4]。

3.2 胎齡對PGCs體外培養的影響PGCs特化形成后，開始向生殖嵴的方向遷移，在遷移的過程中PGCs會進行快速、大量增殖，同時PGCs的遺傳學和表觀遺傳學特性也會發生變化，不同胎齡的PGCs的基因表達譜是不一樣的[6]。因此，選擇合適的胎齡對PGCs的體外培養至關重要。本研究結果顯示E10.5和E11.5兔胚胎PGCs體外培養時，重編程為EGCs集落的效率較高，與之前的研究結果一致[7]。胚胎的早期階段PGCs重編程為EGCs展示出較高的效率，但是PGCs的這種能力隨著胎齡的增長會逐漸降低，在E15.5之后，PGCs不能重編程為EGCs[8]。

3.3 RA、FK和4OHT對PGCs體外培養的影響RA作為生殖功能必要調節因子，顯著增加PGCs在體外遷移階段的細胞數量，延緩PGCs在體外衰老[9-10]。RA生物學功能是通過RA受體RARs所介導，主要有RAR的異二聚體和維甲酸X受體(retinoid X receptor，RXR)。FK和RA作為PGCs的“促分裂劑”，可刺激PGCs的體外增殖和延緩衰退。FK可激活蛋白激酶A下游通路從而明顯促進雞PGCs增殖[11]。RA和FK聯合使用會增加PGCs集落的形成并有利于長期體外培養[12]。另外在培養液中添加4OHT，可激活PGCs內的AKT反應，激活AKT-MER蛋白，從而上調或下調一些關鍵基因的表達，促進PGCs重編程為EGCs，如AKT的激活會使BAX基因表達下調，BAX是BCL2基因家族的一個成員，它的生理功能是促進多種細胞凋亡，包括PGCs。AKT的激活可以替代bFGF在PGCs重編程為EGCs中的作用。本試驗在培養液中加入RA、FK和4OHT 3種小分子復合物比不加入或只加入其中2種的PGCs集落數量要多。

總之，小分子復合物會啟動細胞內信號通路，參與表觀遺傳修飾和代謝過程，調節細胞的生長、命運和功能。小分子復合物被廣泛的用于重編程和轉分化領域，可以促進靶細胞向目標細胞轉化[13]。小分子復合物具有細胞滲透性和非免疫原性[14-16]，此外，它們價格低廉、易于合成和保存。

3.4 FBS和KSR對PGCs體外培養的影響血清中含有已知的和未知的動物源性病原體[17]，這可能會導致人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)的異物污染，從而阻礙干細胞的臨床應用[18]。因此許多研究者嘗試建立新的培養系統或優化現有培養系統以減少干細胞的污染[17]。本研究結果證明，無血清培養體系更有利于PGCs集落的形成，更有利于體外重編程為EGCs。