HA蛋白S227N突變對H7N9亞型禽流感病毒生物學特性與疫苗免疫原性的影響

胡增壘，石 磊，趙江艷，顧 晗，胡 嬌,4，曹永忠，劉秀梵* (1.揚州大學 教育部農業與農產品安全國際聯合實驗室，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學 農業科技發展研究院，江蘇 揚州 225009；.揚州大學 獸醫學院 農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇 揚州 225009；4.揚州大學 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009；5.揚州大學 江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

H7N9亞型禽流感是嚴重威脅公共衛生與養禽業發展的重要的人獸共患病，H7N9亞型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)于2013年在中國長三角地區出現以來，在我國共造成5個波次的人間流行[1-2]。截至2020年5月，世界衛生組織(WHO)數據統計，共有1 568例實驗室確診人感染H7N9亞型AIV，死亡率接近40%。2016年底，H7N9亞型AIV出現變異毒株，其血凝素(hemagglutinin,HA)裂解點位7出現“KRTA”4個氨基酸插入，使其具備高致病性AIV特征。隨后，在人、雞群、活禽市場與環境樣品中不斷檢出高致病性H7N9亞型毒株[3]。根據世界動物衛生組織(OIE)統計，至2020年5月，高致病性H7N9亞型AIV在我國共造成11起家禽疫情暴發，約80萬只家禽被撲殺。

疫苗接種是禽流感防控的有效措施之一，H7N9亞型AIV出現以來已研制出許多候選疫苗株，包括全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗與病毒載體疫苗等[4]。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)顯示,H7N9亞型疫苗可誘導高水平的HA特異性IgG抗體，但傳統的血清學方法(如HI、VN試驗)測定的抗體滴度卻不能反映疫苗真實的免疫原性。這些疫苗在動物試驗中均顯示出較強的免疫原性與保護效力，在人臨床試驗中，疫苗誘導的血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)與病毒中和(virus neutralization,VN)抗體普遍偏低，往往需要進行加強免疫或在疫苗中添加佐劑[5-6]。此外，小鼠與家禽中進行的H7N9亞型疫苗評價試驗也得到相似結果[7-10]。

HI試驗測定抑制流感病毒與紅細胞唾液酸體結合的抗體，因此HI試驗的敏感性是決定流感疫苗HI抗體檢測率的關鍵因素。HI試驗所用診斷抗原的受體結合特性對其敏感性有重要影響。研究顯示，HA蛋白中一些影響病毒受體特異性的關鍵位點，如受體結合位點(receptor binding site,RBS)中第190、226與228位氨基酸(基于H3亞型流感病毒HA蛋白計數)，對流感疫苗的免疫原性與效力有重要作用[11-13]。一些H5亞型禽流感疫苗(如H5N3亞型A/Duck/Singapore/3/97；H5N1亞型A/HK/156/97)誘導的HI或VN抗體滴度很低，但某些H5亞型疫苗(如H5N1亞型A/HK/156/97)卻可以誘導很高的HI抗體。序列分析顯示，免疫原性較弱的病毒HA蛋白RBS第227位氨基酸均為絲氨酸(S)，免疫原性較強的病毒該位點為天冬氨酰(N)，提示227位氨基酸位點可能與H5亞型禽流感疫苗的免疫原性有關。LIPATON等[15〗報道，將H5N1亞型AIV(A/Vietnam/1203/04)HA蛋白第227位S突變為N后，疫苗在雪貂中誘導的HI抗體顯著提高，且不同的H5病毒抗血清與含有S227N突變病毒的HI滴度均顯著提高，說明S227N突變增強了HI抗體的檢測敏感性。后續研究在更多的H5亞型禽流感疫苗中驗證了S227N突變對疫苗免疫原性的增強作用，且證明S227N突變對病毒受體結合特性的改變可能與HI抗體的提高有相關性[16]。但HA蛋白第227位氨基酸與H7N9亞型禽流感疫苗較低的HI抗體應答是否相關還不清楚。

本課題組前期以H7N9亞型AIV(A/chicken/Guangdong/GD15/2016,GD15株)為母本病毒，構建HA蛋白裂解位點突變的致弱病毒(rGD15)及含有HA S227N突變的重組病毒(rGD15HAS-227N)[17]。本研究評價HA蛋白S227N突變對病毒致病性、復制、受體結合特性的影響，并分析該位點突變對疫苗免疫原性與血清交叉反應性的影響，為H7N9亞型禽流感疫苗的優化改造提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、質粒與細胞以H7N9亞型AIV(GD15株)為母本病毒，HA蛋白裂解位點去除“KRTA”氨基酸的重組致弱H7N9亞型病毒rGD15株和含有HA S227N突變的重組病毒rGD15HAS227N由胡增壘等[17]構建；H7N9亞型病毒分離株(A/chicken/Guangxi/GX110/2017、A/chicken/Hebei/SJ27/2017、A/chicken/Guangdong/HZLH1/2017、A/ch-icken/Jiangsu/TM24/2013、A/chicken/Zhejiang/J-X148/2014、A/chicken/Jiangsu/RG126/2015)由農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室分離保存，作為交叉HI試驗的抗原；H5N1亞型AIV(A/mallard/Huadong/S/2005,HD/05株)與人源H1N1亞型毒株(A/California/04/2009,CA04株)由本室保存，用于病毒受體特性測定對照；293T與MDCK細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養；雞胚成纖維細胞(CEF)按照常規方法制備，在含有4%胎牛血清的M199培養基中培養。

1.2 H7N9亞型免疫血清前期基于rGD15與rGD15HAS227N制備了油乳劑滅活疫苗，免疫SPF雞后獲得H7N9亞型抗血清；用其他H7N9亞型病毒(JX148、TM24、RG126、SJ27)為抗原制備的免疫雞血清均由本實驗室保存。

1.3 雞胚與主要試劑SPF雞胚購自浙江立華農業科技有限公司，孵化至10日齡使用；生物素標記的α-2,3(Neu5Acα-2,3-LacNAcb-PAA-biotin)與α-2,6糖鏈(Neu5Acα-2,6LacNAcb-PAA-biotin)購自GlycoTech公司；H7N9亞型 HA蛋白特異性單克隆抗體購自北京義翹神州公司。

1.4 H7N9亞型病毒生物學特性的鑒定按照文獻[18]方法測定母本病毒rGD15與突變病毒rGD15HAS227N接種SPF雞胚后的平均死亡時間(MDT)，評價病毒的致病性；測定病毒的HA效價與半數雞胚感染劑量(EID50)，評價病毒的繁殖性能；將H7N9亞型病毒接種SPF雞胚，于接種后24、48、72、96 h收獲尿囊液，并感染CEF細胞測定病毒的半數組織細胞感染量(TCID50)，評價病毒的生長動力；利用基于固相載體的糖鏈試驗測定H7N9亞型病毒的受體結合特性。

1.5 HA蛋白結構的模擬分析為了分析S227N突變對HA蛋白的結構的影響，將GD15株HA氨基酸序列與含有S227N突變的序列上傳至SWISS-MODEL數據庫(https://www.swissmodel.expasy.org/)進行同源建模[19]，并用PyMOL軟件對HA蛋白結構進行分析。

1.6 HI抗體測定測定GD15與rGD15HAS227N疫苗免疫雞后第2、3周采集血清的HI抗體滴度，按照標準流程進行，所用抗原為疫苗的同源病毒。

1.7 交叉HI試驗為了評價S227N突變對H7N9亞型疫苗免疫血清交叉反應性的影響，用rGD15與rGD15HAS227N滅活疫苗免疫血清與H7N9亞型野毒株進行交叉HI試驗；為了分析S227N突變對HI試驗敏感性的影響，用不同的H7N9亞型抗血清與rGD15與rGD15HAS227N病毒進行交叉HI試驗。

2 結果

2.1 含有HA S227N突變的H7N9亞型重組病毒的生物學特性重組病毒rGD15HAS227N及其母本病毒rGD15對雞胚的MDT均大于120 h，顯著高于野生型病毒GD15株的MDT值(36 h)，說明HA裂解位點去除“KRTA”氨基酸使病毒致病性顯著降低(表1)。rGD15與rGD15HAS227N的HA效價與EID50與野生病毒相似，均保持在較高水平(表1)。此外，病毒生長曲線顯示，rGD15HAS227N在雞胚中的復制性能略低于rGD15，但是每個時間點的病毒滴度差異維持在1 lg之內(圖1)。以上結果說明，HA蛋白S227N突變對母本病毒rGD15的致病性與復制性能無明顯影響。

表1 H7N9亞型重組病毒的生物學特性

圖1 H7N9亞型重組病毒在雞胚中的生長曲線

2.2 H7N9亞型病毒的受體結合特性與HA蛋白結構模擬分析由于227位點位于HA蛋白的RBS內，故用糖鏈結合試驗評價S227N突變對H7N9亞型病毒受體結合特性的潛在影響。結果發現，H7N9亞型病毒rGD15與α-2,3及α-2,6唾液酸受體均顯示較高的親和力(圖2A)，說明該病毒為雙受體結合特性；rGD15HAS227N也可與α-2,3及α-2,6唾液酸受體結合，但是親和力與母本病毒rGD15相比明顯下降(圖2B)。對照病毒H5N1亞型AIV HD/05株僅結合α-2,3唾液酸受體(圖2C)，而人源H1N1 CA04株僅結合α-2,6唾液酸受體(圖2D)，說明2個對照病毒均為單受體結合特性，糖鏈結合試驗成立。此外，HA蛋白構象模擬顯示，227位氨基酸殘基位于HA蛋白RBS的220-loop內(圖2E)；S在HA蛋白表面占據的分子空間較小，N占據的分子空間更大，但是位點突變對與唾液酸受體直接結合的位點(226與228位)的構象沒有明顯影響(圖2F)。結果說明，HA S227N突變不改變GD15株的雙受體結合特性，卻可以導致病毒與唾液酸受體親和力的顯著下降，使病毒與受體的結合更加松散；受體特性的改變可能與S227N突變導致的HA蛋白構象變化有關。

A.H7N9-rGD15;B.H7N9-rGD15HAS227N;C.H5N1-HD/05;D.H1N1-CA04;E.227位氨基酸在HA RBS中的定位;F.RBS內關鍵位點(226，227，228位)在HA蛋白表面的構象

2.3 S227N突變對H7N9亞型疫苗免疫原性的影響疫苗免疫后第2周，rGD15誘導的平均HI抗體滴度為3.8 log2，rGD15HAS227N誘導的HI抗體滴度為5.4 log2，兩者之間的差異接近4倍(圖3A)。免疫后第3周，兩個疫苗誘導的抗體水平均明顯上升，rGD15HAS227N誘導的HI滴度(7.4 log2)顯著高于rGD15(5.5 log2)(圖3B)。說明S227N突變可以顯著提高H7N9亞型滅活疫苗誘導的HI抗體水平。

A.第2周;B.第3周；*P <0.05；虛線代表HI試驗陽性讀數的臨界值4 log2

2.4 S227N突變對H7N9亞型免疫血清交叉反應性的影響交叉HI試驗顯示(表2)，rGD15血清與同源抗原的HI滴度為6 log2，與rGD15HAS227N抗原的HI滴度上升4倍(8 log2)。此外，rGD15血清與近期高致病性H7N9亞型分離株(2017年)及早期低致病性毒株(2013—2015年)的HI滴度均與同源滴度相近。rGD15HAS227N血清與同源抗原的HI滴度為8 log2，與rGD15病毒的HI效價下降4倍；與H7N9亞型野毒株的交叉反應性與rGD15的反應譜相似。結果表明，rGD15血清與不同的H7N9亞型分離株有較好的交叉反應性，而HA S227N突變對這一特性無明顯影響。

表2 H7N9亞型疫苗免疫血清的交叉反應性

2.5 S227N突變對HI試驗敏感性的影響測定不同H7N9亞型血清與rGD15及rGD15HAS227N病毒的HI滴度，評價S227N突變對HI試驗敏感性的影響。結果顯示，所有H7N9亞型血清與rGD-15HAS227N病毒的HI滴度比針對rGD15病毒的滴度均上升2 log2(表3)，說明用含有S227N突變的病毒作為檢測抗原，HI試驗的敏感性上升4倍。

表3 H7N9亞型血清與H7N9亞型重組病毒的HI滴度

3 討論

HI抗體滴度是評價流感疫苗免疫原性與保護效力最常用的免疫學指標。對于成人的季節性流感疫苗，HI抗體滴度大于1∶40認為可將流感病毒的感染風險降低50%左右[20-21]。對于家禽流感疫苗，HI抗體水平大于1∶32認為可提供較好的臨床保護。但是，動物模型與人群中的免疫試驗顯示，H7N9亞型禽流感疫苗誘導的HI抗體普遍較低，往往低于HI試驗的檢測下限[5-6]。因此，許多研究基于這種抗體應答特征認為H7N9亞型禽流感疫苗的免疫原性較弱。但利用ELISA方法可以檢測到H7N9亞型疫苗誘導高水平的IgG抗體，說明疫苗具有較強的免疫原性，而傳統的血清學試驗(如HI試驗)不能真實反映疫苗誘導的抗體應答。

有報道顯示，HA蛋白中與唾液酸受體直接結合的位點(第226與228位氨基酸)與流感疫苗的免疫原性密切相關[11-12,22]。此外，HA蛋白RBS內的其他關鍵位點，如第227位氨基酸，對流感疫苗的免疫原性也有重要影響。HOFFMANN等[14]研究顯示，HA蛋白第227位氨基酸為S的H5N1亞型禽流感疫苗誘導的HI抗體滴度很低，而該位點為N的疫苗則可以誘導高水平HI抗體；S227N突變能夠顯著增強疫苗的免疫原性，且S227N突變改變H5N1病毒受體結合特性，顯著提高HI試驗的敏感性。本研究得到相似結果，HA蛋白S227N突變使H7N9亞型AIV與α-2,3及α-2,6唾液酸受體的親和力顯著下降，病毒與受體的結合更為松散。含有S227N突變的H7N9亞型疫苗誘導的HI抗體顯著高于未突變疫苗誘導的抗體，與突變病毒受體結合特性改變相關。此外，其他H7N9亞型血清針對含有S227N突變病毒的HI滴度比針對未突變病毒的滴度均增加4倍。這些結果說明，使用含有S227N突變的H7N9亞型重組病毒作為診斷抗原可顯著提升HI試驗的敏感性。

H7N9亞型AIV為典型的雙受體結合特性，病毒與α-2,3及α-2,6唾液酸受體均有較強的親和力[23]。因此，使用H7N9亞型病毒作為HI抗體檢測抗原時，需要較高濃度的抗體才能阻斷病毒與紅細胞唾液酸受體的結合，降低HI試驗的敏感性。S227N突變可降低病毒與受體的親和力，但具體的機制還不清楚。本研究中HA結構模擬提示，S227N突變改變了氨基酸位點在HA蛋白表面占據的分子空間，但是這種改變與病毒受體特性變化之間的相關性還有待研究。

此外，近期分離的H7N9亞型AIV與早期毒株之間存在明顯的抗原性差異。較廣的反應譜是高效H7N9亞型禽流感疫苗的理想特性。結果顯示，rGD15免疫血清與不同的H7N9亞型野毒株均具有較好的交叉反應性，而S227N突變對血清的反應譜沒有明顯影響，說明該位點突變不影響H7N9亞型病毒的抗原性。

綜上，本研究證實HA蛋白第227位氨基酸位點對H7N9亞型禽流感疫苗免疫原性的評價有重要影響。HA S227N突變可改變病毒的受體結合特性、增加HI試驗的敏感性、增強H7N9亞型疫苗的免疫原性。研究結果對于H7N9亞型禽流感疫苗免疫原性的增強及疫苗的臨床評價有重要的參考意義。