豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲雙重巢式PCR檢測方法的建立

王朋林，陳凱麗，鄭 玲，劉林科，王榮軍，張龍現，寧長申，菅復春 (河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450046)

豬囊孢球蟲(Cystoisosporasuis)原名豬等孢球蟲(Isosporasuis)，歸類于真球蟲目(Eucoccidiorida)、肉孢子球蟲科(Sarcosporidae)、囊等孢球蟲屬(Cystoisospora)。豬囊孢球蟲可感染不同品種和不同年齡階段的豬，尤其對哺乳仔豬的危害最為嚴重，臨床癥狀可表現為非出血性腹瀉[1]，治療不當會導致僵豬或死亡，嚴重影響我國養豬業的發展。畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)是一種可感染人和多種動物胃腸道的人獸共患病原。1985年首次在艾滋病(HIV)患者中發現[2]。一般情況下，感染此病原后免疫功能正常的機體無明顯的臨床癥狀，但對HIV患者和免疫功能低下的兒童會造成持續性腹瀉并伴有發熱、食欲下降和體質量減輕等癥狀[3]。此外，畢氏腸微孢子蟲感染宿主廣泛，如非人靈長類動物(NHP)、反芻動物、哺乳動物、嚙齒動物等，并對它們的胃腸道造成嚴重損傷，因此引起世界各國研究者的高度關注[4]。近年來，隨著分子生物學技術的快速發展，具有簡便、快速、準確等優點的PCR檢測技術已被廣泛應用于各種腸道原蟲的分子流行病學調查[5-7]。目前尚無關于豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的雙重nest-PCR方法，本研究旨在建立一種快速、準確、簡便、可同時診斷豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的雙重nest-PCR方法，以期能快速鑒定兩種病原，為豬腸道原蟲病的防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 病原豬囊孢球蟲、畢氏腸微孢子蟲、安氏隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲均由本實驗室分離鑒定;大腸桿菌菌株由本院微生物學實驗室饋贈。

1.2 試劑KOD plus DNA聚合酶、TAE緩沖液、瓊脂糖、雙蒸水、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa有限公司；E.Z.N.A.?D4015-02糞便全基因組DNA提取試劑盒購自OMEGA有限公司。

1.3 引物合成使用DNAStar等工具對2對nest-PCR引物兼容性進行檢測，避免各組引物間形成二聚體。2對引物均由上海生物工程公司合成。

表1 雙重nest-PCR引物序列及擴增產物大小

1.4 DNA 模板的制備取待檢豬的陽性糞便20～50 g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本180～220 mg至1.5 mL離心管中，按E.Z.N.A.?D4015-02糞便全基因組DNA提取試劑盒提取說明書提取模板DNA。

1.5 雙重nest-PCR反應條件的優化在豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲單病原檢測nest-PCR檢測方法穩定反應的基礎上，將豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的DNA等量混勻物作為模板，對雙重nest-PCR中的引物比、Buffer、dNTPs、酶、Tm值、循環數等各項反應條件進行優化，篩選雙重nest-PCR擴增的最佳反應體系和條件。

1.6 特異性試驗將分別用傳統鏡檢及nest-PCR鑒定后確定的豬囊孢球蟲與畢氏腸微孢子蟲混合物、豬囊孢球蟲、畢氏腸微孢子蟲、安氏隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲和大腸桿菌等DNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應結束后取5 μL產物用于1 %瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.7 敏感性試驗使用Nano Drop 2000超微量分光光度計分別測量豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲質粒標準品的濃度，并進行PCR擴增。豬囊孢球蟲質粒標準品的原始質量濃度為209 mg/L(D260/D280=1.86)，畢氏腸微孢子蟲質粒標準品的原始質量濃度為527 mg/L(D260/D280=1.84)，D260/D280=1.80～2.00時，證明核酸純度較好。分別將兩種病原的質粒標準品進行10倍倍比稀釋(豬囊孢球蟲：209～209×10-8mg/L；畢氏腸微孢子蟲：527～527×10-8mg/L)后作為模板，進行豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲雙重nest-PCR方法的敏感性試驗。

1.8 重復性試驗使用建立的雙重nest-PCR方法隨機選擇3個混合感染豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲DNA樣品進行重復性檢測，以保證該方法對豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲檢測的穩定性與可行性。

1.9 臨床樣品的檢測用本試驗建立的雙重nest-PCR方法對采自河南信陽的48份豬糞便DNA樣品進行PCR檢測，并與豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的單病原nest-PCR方法進行比較。檢測結果通過雙向測序，對基因序列進行比對分析以排除假陽性。

2 結果

2.1 雙重nest-PCR引物比優化結果將畢氏腸微孢子蟲和豬囊孢球蟲引物比分別按照1.00∶0.25、1.00∶0.50、1.00∶0.75、1.00∶1.00進行擴增。結果顯示畢氏腸微孢子蟲和豬囊孢球蟲的引物量的比為1.0∶0.25時有穩定雙條帶出現。圖1為3個不同的畢氏腸微孢子蟲和豬囊孢球蟲DNA混合物在兩者引物量比為1.00∶0.25時的擴增結果。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.畢氏腸微孢子蟲和豬囊孢球蟲DNA混合物；4.陰性對照

2.2 雙重nest-PCR退火溫度優化結果結果顯示，雙重nest-PCR在50～60℃范圍內擴增效率變化不大，由于豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲單重nest-PCR 2次擴增的退火溫度分別為57和55℃，因此本試驗選擇將第1輪、第2輪退火溫度分別確定為57、55℃(圖2、3)。

M.DL2000 DNA Marker;1～9.分別為60.0、59.2、58.0、57.0、56.1、53.8、51.9、50.7、50.0℃；10.陰性對照

2.3 雙重nest-PCR特異性試驗結果瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲混合物、豬囊孢球蟲、畢氏腸微孢子蟲均擴增出相應的特異性條帶，而安氏隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲、大腸桿菌均未擴增出特征性條帶，證明本試驗特異性良好(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker;1～7.微孢子蟲+豬囊孢球蟲、豬囊孢球蟲、微孢子蟲、安氏隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲、E.coli;8.陰性對照

2.4 雙重nest-PCR敏感性試驗結果按照已優化的反應條件及體系進行雙重nest-PCR敏感性試驗，DNA模板與豬囊孢球蟲、畢氏腸微孢子蟲單病原nest-PCR試驗相同。結果顯示，豬囊孢球蟲的最低檢測限為209×10-5mg/L，畢氏腸微孢子蟲的最低檢測限為527×10-7mg/L(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.分別為2種病原質粒10倍倍比稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；10.陰性對照；6.209×10-5 μg/L;8.527×10-7 μg/L

2.5 雙重nest-PCR重復性試驗結果用建立的雙重nest-PCR方法隨機選擇3個豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的陽性DNA樣品進行重復性檢測，結果顯示，雙重nest-PCR方法檢測豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲具有良好的重復性和穩定性(圖6)。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.樣品；4.陰性對照

2.6 雙重nest-PCR臨床樣品檢測用本試驗建立的豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲雙重nest-PCR方法對采自信陽的48份豬糞便DNA樣品進行PCR擴增，單病原nest-PCR擴增豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲感染陽性率分別為12.50%(6/48)和22.92%(11/48)，混合感染陽性率為4.17%(2/48)；雙重nest-PCR豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲感染陽性率分別為20.83%(10/48)和8.33%(4/48)，混合感染陽性率為4.17%(2/48)；單重nest-PCR和雙重nest-PCR檢測結果無統計學差異(P>0.05)。表明建立的雙重nest-PCR可用于臨床檢測。

表2 單重nest-PCR和雙重nest-PCR對豬臨床糞便樣品檢測結果比較

3 討論

多重nest-PCR反應是在同一反應體系中，同時加入多個特異性引物進行擴增，但多對引物之間的配比、相互競爭及抑制等均會影響多重nest-PCR的擴增結果[8]，因此，篩選合適的引物并調整最佳引物配比，是保證試驗順利進行的基本要素。此外，合適的多重nest-PCR引物不但要求能特異和敏感地擴增出目的條帶，各引物間還要有相近的退火溫度和循環數。本試驗所選擇的2對引物，其GC%含量和Tm值相近，為豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲均能得到良好的擴增以及雙重nest-PCR方法的建立奠定了基礎。本試驗初期進行雙重nest-PCR反應時，將豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲引物按等量加入，同時擴增兩個特異性基因時，豬囊孢球蟲的擴增效率高于畢氏腸微孢子蟲的擴增效率。因此，可通過調整加入的引物量比來實現使各引物的擴增效率相近的產物[9]。

豬囊孢球蟲單病原nest-PCR的敏感度為209×10-6mg/L，敏感性比雙重nest-PCR高10倍；畢氏腸微孢子蟲單病原nest-PCR最低檢測限限為527×10-9mg/L，與雙重nest-PCR敏感性相比高100倍，這與彭武麗等[10]報道的單PCR敏感性高于多重PCR敏感性一致，但處于可接受水平。造成此敏感性差異的原因眾多，比如引物之間的互作和反應參數的差異等。本研究同時使用單nest-PCR方法和建立的雙重nest-PCR方法對采自信陽的48份糞便DNA樣品進行檢測。結果表明，單nest-PCR的檢出率略高于雙重nest-PCR，經統計學分析，單nest-PCR和雙重nest-PCR檢測結果差異并不顯著(P>0.05)。這一結論與MORIO等[11]對首個商業化檢測糞樣中的隱孢子蟲、腸畢氏微孢子蟲和腸腦炎微孢子蟲多重PCR試劑盒的評估結果相一致。究其原因可能是因為雙重nest-PCR中同時加入了兩種腸道病原引物，增加了干擾因素，在一定程度上降低了目的基因片段的擴增效率，但誤差仍處于可接受范圍內。雙重nest-PCR方法與單重nest-PCR方法相比，只做1次nest-PCR擴增就可同時檢測出2種病原，大大節省試驗時間、精力和試劑消耗，顯著提高檢測效率。綜上所述，本研究所構建的雙重nest-PCR方法具有良好的敏感性、特異性，可用于臨床樣品的檢測。