共表達(dá)PCV2 Cap蛋白和IL-2重組變異株偽狂犬病病毒構(gòu)建及對小鼠的免疫原性

時慶賀，馬寧寧，劉 占，鄧夢夢，郭子儀，史志斌，陳 陸，王川慶 (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)。PCV2感染能夠引起機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，易并發(fā)和繼發(fā)其他傳染病，從而增加豬群的發(fā)病率和死亡率。ORF2編碼的Cap蛋白可與宿主細(xì)胞的病毒受體結(jié)合，是PCV2主要的免疫原蛋白[1-3]。自2011年底以來，偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)變異株在我國大部分地區(qū)流行造成豬偽狂犬病(porcine pseudorabies，PR)再次暴發(fā)，已有的PR基因缺失活疫苗不能對PRV變異毒株提供100%保護(hù)的報道[4]。白介素2(interleukin 2，IL-2)作為免疫佐劑能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的殺傷作用，提高單核巨噬細(xì)胞吞噬和抗原識別能力，在細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，克服了傳統(tǒng)佐劑的缺點[5-7]。因此，IL-2有望成為一種安全、經(jīng)濟(jì)、高效的新型免疫佐劑。基于PR基因缺失活疫苗的成功應(yīng)用以及PRV大部分基因如TK基因[8]是病毒復(fù)制非必需的。因此，將PRV流行變異株作為載體，在其基因組上插入外源基因，構(gòu)建病毒活載體疫苗可達(dá)到“一針多防”的效果[9]。本研究擬將PCV2 YY株ORF2和豬IL-2基因插入到前期用PRV QYY變異株構(gòu)建的rPRV-gE-/TK-/EGFP+缺失的TK基因位點，評價重組病毒免疫原性，以期獲得有效預(yù)防PMWS及PR的重組活載體疫苗株。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及毒株含有CMV啟動子和polyA尾的pZJ-1真核表達(dá)載體及以pMD18-T為載體含有PRV TK基因上下游同源臂的重組質(zhì)粒pTK、rPRV-gE-/TK-/EGFP+毒株和rPRV-gE-/TK-/ORF2+重組病毒為本實驗室構(gòu)建并保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、人腎上皮細(xì)胞(293T)、倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、PRV QYY株(2012年分離流行株)和PCV2 YY毒株(PCV2d)為實驗室保存。

1.2 主要試劑羊抗豬IL-2多克隆抗體購自Novus公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-兔抗羊、HRP-羊抗鼠IgG和FITC-羊抗鼠IgG購自三鷹生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司；抗鼠CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PercP、IFN-γ-APC、IL-4-APC 和IL-12單克隆抗體、Brefeldin A、Fixation Buffer、Perm Wash Buffer和Cell Staining Buffer為Biolegend公司產(chǎn)品；細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK-8)購自武漢博士德有限公司；抗PCV2 Cap鼠單克隆抗體和原核表達(dá)的Cap蛋白為本實驗室制備。

1.3 重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+的構(gòu)建據(jù)GenBank收錄 PCV2(KU960941.1)和 IL-2(X58428.1)基因序列，應(yīng)用Primer Primer 5.0設(shè)計特異性引物F1/R1和F2/R2，分別用于擴(kuò)增PCV2 ORF2和IL-2基因；在TK基因上游同源臂(TKU)及下游同源臂(TKL)設(shè)計1對特異性引物F3/R3，擴(kuò)增含有TK基因上、下游同源臂和ORF2-IL-2基因表達(dá)框的片段TKU-CMV-ORF2-IL-2-polyA-TKL(表1)。相應(yīng)限制性內(nèi)切酶分別雙酶切ORF2和IL-2基因擴(kuò)增片段，KpnⅠ、HindⅢ雙酶切pZJ-1質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物純化連接，得到重組質(zhì)粒pZJ-ORF2-IL-2。NheⅠ和SpeⅠ雙酶切pZJ-ORF2-IL-2得到CMV-ORF2-IL-2-polyA片段，與用SpeⅠ酶切并進(jìn)行去磷酸化處理的pTK連接，得到重組質(zhì)粒pTK-ORF2-IL-2并進(jìn)行酶切鑒定。用高保真酶以pTK-ORF2-IL-2為模板通過PCR擴(kuò)增出TKU-CMV-ORF2-IL-2-polyA-TKL，經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定及分離純化。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)293T細(xì)胞單層長至80%時，參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒說明，將TKU-CMV-ORF2-IL-2-polyA-TKL基因片段與rPRV-TK-/gE-/EGFP+基因組DNA共轉(zhuǎn)染，細(xì)胞病變80%時收毒、離心取上清接種Vero細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)病變，在熒光倒置顯微鏡下挑取無熒光蝕斑并連續(xù)純化鑒定，得到重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+。

表1 引物序列信息

1.4 Western blot鑒定重組病毒Cap蛋白和IL-2表達(dá)重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+接種BHK-21細(xì)胞，細(xì)胞病變80%時棄上清，RIPA(含1 mmol/L蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞后收取蛋白；取 20 μL SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入抗Cap蛋白單抗和抗IL-2多克隆抗體，37℃反應(yīng)2 h；TBST洗3次，分別加入HRP-兔抗鼠二抗和HRP-兔抗羊二抗，搖床中60 r/min孵育1 h；TBST洗3次，ECL顯色試劑盒顯色。

1.5 重組病毒一步生長曲線測定分別將重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+、rPRV-gE-/TK-/EGFP+和PRV QYY親本株按1 MOI接種于6孔板中單層Vero細(xì)胞，每隔6 h收取病毒液，凍融3次，測定不同時間點病毒滴度，按Reed-Muench法計算TCID50，繪制病毒一步生長曲線。

1.6 重組病毒對小鼠的安全性試驗選擇25只6～8周齡健康且PRV、PCV2血清學(xué)檢測均為陰性的昆明鼠，隨機(jī)分為5組，每組5只。1～3組分別以每只105TCID50、106TCID50、107TCID50劑量接種rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+；第4組接種 PRV QYY毒株,105TCID50/只；第5組注射100 μL DMEM作為陰性對照背部皮下注射，每天觀察鼠的臨床變化，觀察期為14 d。

1.7 重組病毒對鼠的免疫原性評價將25只雌性昆明鼠隨機(jī)分成5組，每組5只，免疫方案見表2。首免時及隨后每周對小鼠進(jìn)行斷尾采血并分離血清，分別用前期建立的間接ELISA方法[10]和中和抗體試驗檢測各組小鼠血清中抗PCV2抗體及PRV中和抗體水平；二免后4周，無菌分離并制備3×106個/mL的各免疫組鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液，并加入Cap蛋白刺激(5 mg/L)，利用細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性檢測試劑盒(CCK8)檢測各組鼠淋巴細(xì)胞增殖活性，以刺激指數(shù)(SI)作為淋巴細(xì)胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)[11-12]方法進(jìn)行改進(jìn)，取專用流式管分別加入1 mL上述各組細(xì)胞懸液；加入 Cap蛋白(5 mg/L)刺激1 h；加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑Brefeldin A(1 000×)，1 μL/管，作用4 h；Cell Staining Buffer洗滌細(xì)胞，每管加入1 μg 抗鼠CD3-FITC、0.25 μg CD4-PE和0.25 μg CD8-PerCP，輕輕混勻4℃避光孵育30 min；洗滌細(xì)胞，室溫避光下用0.5 mL Fixation buffer固定20 min；充分洗滌細(xì)胞，室溫避光下加入1 mL Perm Wash Buffer進(jìn)行細(xì)胞打孔10 min；分別加入1 μg 抗鼠IFN-γ-APC、0.25 μg IL-4-APC或0.25 μg IL-12-APC，室溫避光孵育30 min；Perm Wash Buffer充分洗滌細(xì)胞，用500 μL 1%多聚甲醛固定液重懸固定細(xì)胞，BD FACS Aria Ⅲ流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析各免疫組小鼠脾臟CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞變化及IFN-γ、IL-4和IL-12細(xì)胞因子的分泌水平。

表2 小鼠分組與免疫方案

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行分析，差異比較采用t檢驗，以P<0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒的構(gòu)建與鑒定TKU-CMV-ORF2-IL-2-polyA-TKL基因片段與rPRV-TK-/gE-/EGFP+基因組DNA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)染混合液離心取上清接種Vero細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下挑取無熒光蝕斑并連續(xù)純化。Western blot檢測重組病毒Cap和IL-2蛋白表達(dá)結(jié)果見圖1。PCV2 Cap蛋白大小為27.8 kDa，IL-2大小約為15.0 kDa，與預(yù)期相符，重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+能夠表達(dá)Cap和IL-2蛋白，表明重組病毒構(gòu)建成功。

M.預(yù)染蛋白Marker;A1.PCV2 YY株接種PK15細(xì)胞作為陽性對照;A2/B1.未接毒細(xì)胞空白對照;A3/B2.rPRV-gE-/TK-EGFP+接毒陰性對照;A4/B3.rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+接種BHK-21細(xì)胞收取蛋白

2.2 重組病毒一步生長曲線rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+、rPRV-gE-/TK-/EGFP+和PRV QYY親本株在Vero細(xì)胞上一步生長曲線見圖2。結(jié)果顯示，重組病毒與PRV QYY株及雙缺失毒株有相類似的生長動力學(xué)，隨著時間的增加病毒滴度逐漸增加，42 h時達(dá)到最高，隨后開始下降，增殖速度和病毒滴度與雙缺失毒株相似。

圖2 重組病毒和親本毒株的一步生長曲線

2.3 重組病毒對小鼠的安全性PRV QYY接種小鼠出現(xiàn)精神沉郁、角弓反張、奇癢等癥狀，3 d內(nèi)全部死亡。接種3種不同劑量重組病毒的試驗小鼠及陰性對照組在14 d的觀察期內(nèi)均沒有發(fā)病癥狀，狀態(tài)良好，說明重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+的毒力大大減弱，致病性降低。

2.4 免疫小鼠抗PCV2抗體間接ELISA方法測定各組鼠血清中抗PCV2抗體水平見圖3。rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+、rPRV-gE-/TK-/ORF2+與PCV2亞單位疫苗免疫小鼠的抗體水平在首免后3周內(nèi)迅速升高，在二免后抗體水平呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，三者抗體水平變化趨勢一致，且在二免后rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+與PCV2亞單位疫苗免疫組抗體水平相差不大，但均高于rPRV-gE-/TK-/ORF2+免疫組。DMEM和PR活疫苗免疫小鼠均沒產(chǎn)生抗PCV2抗體。結(jié)果表明，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生抗PCV2抗體，豬IL-2可以增強(qiáng)機(jī)體特異性體液免疫。

圖3 免疫小鼠抗PCV2抗體水平變化

2.5 免疫小鼠抗PRV中和抗體水平免疫小鼠抗PRV中和抗體結(jié)果見圖4，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+與PRV活疫苗免疫組在首免后2周均產(chǎn)生了抗PRV中和抗體，且中和抗體水平與rPRV-gE-/TK-/ORF2+免疫組相比差異顯著(0.01

注：*.0.01

2.6 免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗及細(xì)胞因子的檢測

2.6.1免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+和PCV2亞單位疫苗免疫組的脾臟淋巴細(xì)胞受Cap蛋白刺激后增殖最為明顯，淋巴細(xì)胞體積變大、數(shù)量增多，DMEM組淋巴細(xì)胞狀態(tài)沒有明顯變化，說明重組病毒能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖。從圖5可知，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組與DMEM對照組和PRV活疫苗免疫組相比小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性差異極顯著(P<0.01)，與rPRV-gE-/TK-/ORF2+免疫組相比差異顯著(0.01

圖5 免疫小鼠T淋巴細(xì)胞增殖活性

2.6.2免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子檢測 免疫小鼠脾臟CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群變化及細(xì)胞因子的分泌水平見圖6。與DMEM對照組相比，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+、rPRV-gE-/TK-/ORF2+、PCV2亞單位疫苗及PRV活疫苗免疫組的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比及分泌特異性IFN-γ、IL-4和IL-12的水平均明顯升高，且rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組最高，說明重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+能引發(fā)小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對Cap蛋白的Th1型和Th2型免疫應(yīng)答。

A～C.為CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平;D.PCV2 Cap蛋白特異性T淋巴細(xì)胞因子表達(dá)

3 討論

2011年底，PRV變異株在我國豬場出現(xiàn)，現(xiàn)有商品化疫苗的保護(hù)效力顯著下降，不能有效阻斷其傳播和流行[13]。PRV宿主范圍廣、基因組大，可供外源基因插入或替代，缺失一個或多個病毒復(fù)制非必需基因，病毒毒力可減弱，而自身繁殖和免疫原性不受影響，攜帶外源抗原基因進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，可刺激機(jī)體同時產(chǎn)生對PRV和外源抗原的免疫應(yīng)答，且免疫原性持久，克服了滅活疫苗和弱毒疫苗的缺點[14-15]。動物機(jī)體出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少和免疫功能抑制等特征是感染PCV2的重要標(biāo)志[16]。CD3+代表全T淋巴細(xì)胞，包括輔助型T細(xì)胞CD4+和殺傷型T細(xì)胞CD8+。CD8+可直接殺傷靶細(xì)胞，CD4+協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的相互作用。Th1分泌IFN-γ和IL-12促進(jìn)細(xì)胞免疫，Th2分泌IL-4促進(jìn)體液免疫。因此CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞及特異性IFN-γ、IL-4和IL-12細(xì)胞因子的水平變化趨勢可以間接反映機(jī)體免疫功能。

本研究中PCV2間接ELISA和PRV血清中和試驗結(jié)果顯示，IL-2基因可以有效增強(qiáng)機(jī)體特異性體液免疫作用，但ELISA試驗中抗體水平略低于PCV2亞單位疫苗免疫組。由于本研究PCV2亞單位疫苗是用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Cap VLPs，通過純化和濃縮后研制的商品化疫苗，其抗原量要高于rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+重組病毒表達(dá)的Cap蛋白量，所以導(dǎo)致PCV2亞單位疫苗免疫組的抗PCV2抗體水平高于rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組，因此要提高重組病毒中外源蛋白的表達(dá)量和提高病毒的純度。鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗顯示，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯高于同等條件下的其他免疫組。細(xì)胞亞群及相關(guān)因子檢測顯示，與其他組相比 rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組的小鼠脾淋巴細(xì)胞中的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比明顯增加，且IFN-γ、IL-4和IL-12細(xì)胞因子的分泌水平明顯升高。

綜上，PCV2 YY株ORF2和豬IL-2插入到rPRV-gE-/TK-/EGFP+病毒缺失的TK基因位點，獲得的重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+接種小鼠后均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生不同程度的體液和細(xì)胞免疫。重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+比無 IL-2的rPRV-gE-/TK-/ORF2+免疫組在抗PCV2抗體水平、抗PRV中和抗體水平、T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及T淋巴細(xì)胞亞群和相關(guān)因子水平均顯著增加，進(jìn)一步證實了同時攜帶細(xì)胞因子和保護(hù)性抗原的疫苗明顯比單獨含有抗原的疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫。本試驗所用動物為小鼠而并非本屬動物豬，對IL-2作為免疫佐劑的效果是否有一定影響，還需進(jìn)一步開展對豬的免疫原性試驗進(jìn)行驗證。本研究以豬IL-2基因作為免疫佐劑，為研發(fā)同時預(yù)防PR和PCV感染相關(guān)疾病的疫苗提供候選疫苗株。