我國東北部分地區蜱攜帶森林腦炎病毒的分離鑒定

王 迪，姬洪衛，王澤東，李曉慧，張 力，魏 峰，劉 全 (1.吉林農業大學 生命科學學院，吉林 長春 130118；.軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所，吉林 長春 1301；3.佛山科學技術學院 生命工程與科學學院，廣東 佛山 58000)

蜱傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TBEV)是一種臨床上以突發高熱、腦膜刺激癥、頭痛嘔吐、感覺過敏、意識障礙及頸和肢體癱瘓為特征的嗜神經病毒[1]。該病毒分布廣泛，主要流行于歐洲和亞洲地區。在我國主要流行于東北、西北和西南等林區。蜱為TBEV的主要傳播媒介，全溝硬蜱及蓖子硬蜱是TBEV的主要媒介蜱種[2]。

TBEV的基因組為單股正鏈RNA，含有單一閱讀編碼框，編碼3個結構蛋白(C、PrM、E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。其中E蛋白為TBEV的重要結構蛋白，該蛋白內單個氨基酸的改變可影響病毒的毒力和血凝活性等[3]。因此，對于TBEV的分子流行病學研究主要集中于E蛋白中。

近年來，隨著氣候變暖、人類活動范圍擴大，我國森林腦炎又稱蜱傳腦炎(TBE)發病率有明顯上升趨勢[4]。本研究為了解我國東北地區蜱源TBEV的流行及毒株進化情況，通過RT-PCR方法對蜱攜帶TBEV的陽性率及毒株序列突變情況進行分析，為我國東北地區森林腦炎的科學防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蜱樣品采集與鑒定2015年4—6月在吉林省吉林市和黑龍江省雙鴨山市使用布旗法采集游離成年蜱，按照采集地點和形態學進行分類，平均15只/管。GenBank下載已發表的硬蜱科、革蜱屬和血蜱屬的16SrRNA序列，利用Vector NTI軟件設計蜱種鑒定引物，由吉林庫美生物有限公司合成。

1.2 TBEV檢測及統計學分析使用TIANamp Virus RNA Kit 試劑盒提取病毒組RNA，TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit和gDNA Eraser合成cDNA鏈。利用軟件Primer Premier5.0在TBEV E蛋白、保守區設計半巢式檢測引物，上游引物F1：5′-GTBACCATAACAGCYGAGG-3′，上游引物F2：5′-GCCTDCACGCMAAGCTRTCG-3′，下游引物TB-EV-R1：5′-CCRTAGTHTCCCATGGTCA-AG-3′，擴增片段大小為361 bp。利用軟件Pooled-InfRate version 4.0中最大似然估算法計算[5]，分析吉林省吉林市和黑龍江省雙鴨山市3種蜱種的TBEV陽性率。

1.3 TBEV分離及電鏡觀察使用DMEM將TBEV陽性樣本稀釋20倍，接種到非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)，盲傳3代，觀察細胞狀態[6]。將產生病變的Vero細胞上清液負染電子顯微鏡檢測。

1.4 TBEV全基因組擴增根據TBEV檢測結果和GenBank已發表的TBEV序列，利用Primer Premier 5.0、Vector NTI軟件設計TBEV全基因組擴增引物，使用RT-PCR方法陽性樣本進行全基因組擴增(表1)。

表1 TBEV全基因組擴增引物序列

1.5 TBEV系統發育分析以GenBank登錄號、病毒株命名、年份、國家為順序對下載的病毒進行命名。利用MegAlign軟件將所得到的序列進行拼接和同源性分析，MEGA 5.0軟件的鄰位相連法對TBEV全基因組和E蛋白的核苷酸序列構建系統進化樹，選擇Bootstrap method作為測試方法，重復次數設置為1 000次。

2 結果

2.1 蜱鑒定結果本試驗從我國吉林省吉林市和黑龍江省雙鴨山市采集蜱共1 155只，其中吉林省吉林市192只，黑龍江省雙鴨山市963只。通過形態學和分子生物學鑒定，共得到3種蜱：全溝硬蜱655只(56.7%)、森林革蜱90只(34.7%)、嗜群血蜱99只(8.6%)；其中，吉林省吉林市全溝硬蜱102只(53.1%)、草原革蜱90只(46.9%)。黑龍江省雙鴨山市全溝硬蜱553只(57.4%)、草原革蜱311只(32.3%)、嗜群血蜱99只(10.3%)。全溝硬蜱為兩地優勢蜱種(圖1、表2)。

表2 蜱種采樣信息統計 只/%

圖1 樣品采集地點分布

2.2 蜱中TBEV攜帶率在本研究中，TBEV僅在全溝硬蜱中檢出，陽性率為4.7%。吉林省吉林市全溝硬蜱陽性率為20.8%，黑龍江省雙鴨山市全溝硬蜱陽性率為1.8%。未在嗜群血蜱、草原革蜱檢出TBEV(表3)。

表3 東北地區蜱攜帶TBEV陽性率

2.3 TBEV分離及電鏡觀察應用Vero細胞成功分離出1株TBEV，電子顯微鏡下觀察細胞出現脫落、變圓現象。對細胞上清液進行負染，通過透射電子顯微鏡觀察發現，其病毒形態呈現典型的黃病毒形態：有包膜，病毒顆粒直徑為30～40 nm(圖2)。

圖2 電子顯微鏡下病變的Vero細胞(A)和負染狀態下的病毒形態(B)

2.4 TBEV全基因組拼接結果本研究成功獲得1株吉林省吉林市蜱源TBEV毒株，命名為JL-75，其全基因組全長為11 095 bp。其中5′-UTR包括131個核苷酸，開放閱讀框位于基因組的132～10 376 bp，包括10 245個堿基，3′-UTR包括727個核苷酸。JL-T75全基因組已上傳至GenBank，登錄號為MN615726。

2.5 TBEV編碼區序列同源性比較將JL-7株與下載的其他基因型代表株的編碼區序列進行比對發現：JL-T75與遠東亞型TBEV的同源性最高，核苷酸同源性為94.1%～98.3%，氨基酸同源性為99.1%～99.4%。其中，與我國疫苗株森張株核苷酸同源性為98.3%，氨基酸同源性為99.1%。而與西伯利亞亞型、歐洲亞型、貝加爾湖亞型、喜馬拉雅亞型TBEV的同源性較低，核苷酸同源性為83.4%～87.6%，氨基酸同源性為92.9%～96.3%(表4)。

表4 TBEV分離株與參考株編碼區核苷酸和氨基酸同源性比較 %

2.6 TBEV全基因組系統進化樹分析根據全基因組序列和編碼E蛋白片段核苷酸序列對JL-75株進行系統進化樹分析，發現JL-75株與我國森張株(JQ650523)親緣關系較近(圖3)。

圖3 蜱源TBEV全基因組和E蛋白核苷酸序列的系統進化樹分析

2.7 TBEV編碼區氨基酸差異位點比較將JL-75株與我國疫苗株森株進行氨基酸差異位點比較，發現共有29個氨基酸位點產生突變。其中，E蛋白有2個氨基酸位點產生突變，分別為Ile-292→Val和Val-351→Ala(表5)。

表5 分離株與森張株氨基酸差異位點比較

3 討論

自我國1942年發現TBEV以來，TBEV在我國人群和野鼠、鳥類、野豬、牛、羊等動物中均有發現，嚴重威脅了我國人民群眾的公共衛生安全和農業經濟發展[7]。我國東北地區森林資源豐富，為蜱和其宿主提供了良好的生活環境[8]。有調查顯示，我國東北部分地區為長期穩定的TBEV自然疫源地[9]。蔡增林等[10]在黑龍江省密山市采集的嗜群血蜱和森林革蜱以及吉林琿春采集的嗜群血蜱中檢測到TBEV，陽性率分別為0.78%、0.77%和0.17%。趙俊偉等[11]在吉林省琿春市采集的森林革蜱中檢測到TBEV，陽性率為1.16%。在本研究中，僅在吉林省吉林市和黑龍省雙鴨山市的全溝硬蜱中檢出TBEV，陽性率分別為20.8%和1.8%，在草原革蜱和嗜群血蜱中未檢出。分析是由于我國東北地區人類活動區域的擴大和退耕還林政策的實施等因素，導致東北地區的優勢蜱種發生了一定的變化，使個別TBEV易感蜱種的數量下降，相對密度變低。

TBEV根據基因組特征可分為3個型，即遠東型、西伯利亞型和歐洲型。不同基因型之間毒力也有所不同，其中遠東型致病性最強，致死率為5%～20%[4]。我國發現或分離的TBEV流行株均為遠東亞型[12]。張桂林等[13]于2017年在我國新疆中哈邊境地區自然保護區的全溝硬蜱和森林革蜱中分離出10株遠東亞型和3株西伯利亞亞型TBEV，并表明同一自然疫源地可同時存在2種基因型。本研究中，在吉林省吉林市的全溝硬蜱中分離出1株TBEV。將獲得的蜱源TBEV毒株JL-T75與其他亞型代表株的編碼區序列和全基因組核苷酸序列進行同源性比對和系統進化樹分析發現，分離株JL-T75屬于致病性最高的遠東亞型TBEV，說明我國東北地區流行的主要TBEV亞型仍為遠東亞型。

TBEV疫苗株森張株是我國50年代的分離株，與森張株相比，本研究新分離TBEV毒株JL-T75雖然存在一定程度的突變，但它們與森張株編碼區核苷酸和氨基酸同源性均高于98%。有研究表明發生在TBEV的E蛋白上關鍵位點(N52→S、D308→K、K311→E、T310→K、H392→Y)的氨基酸的突變可顯著影響病毒的毒力[14-15]。而新分離的JL-T75株與森張株相比，發現主要毒力位點未發生變異，并不會影響TBEV的毒力，推測接種TBEV疫苗后，依然可以產生對新分離的毒株JL-T75的保護作用。綜上所述，本研究為我國東北地區蜱傳TBEV的遺傳進化和有效防控提供了理論基礎。