血清4型禽腺病毒感染SPF雞體內各組織中病毒的動態分布及排毒規律

欒勇嬌，謝芝勛，王 盛，羅思思，張 蕾，謝麗基，謝志勤，鄧顯文，張民秀，張艷芳，曾婷婷，范 晴 (1.廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；.廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001)

禽腺病毒(avian adenovirus,FAdV)屬于腺病毒科腺病毒屬，是沒有囊膜的雙鏈DNA病毒，可分為5個種(FAdV-A～E，12個血清型(FAdV-1～8a和8b～11)[1]。FAdV引起雞和其他禽類的疾病主要有包涵體肝炎[2]、心包積液綜合征[3]和胃潰瘍[4]。1987年，巴基斯坦安卡拉地區首次發現了一種可引起禽類出現心包積液和包涵體肝炎病理變化的疾病，因此稱為“安卡拉病”[5]，又稱為心包積液-肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)，經鑒定該病的病原是血清4型禽腺病毒(FAdV-4)，隨后該病在世界上的多個國家流行，如澳大利亞、印度、韓國、日本、伊拉克、智利和南非[6-11]，給全球各地的家禽養殖業產生了嚴重的經濟影響。2014年以前，我國零星分離到FAdV[12]，自2015年6月，由高致病性的新型FAdV-4引起的HHS在我國山東、河南、安徽、河北、吉林等省份暴發并迅速傳播[13]。有報道稱種雞、蛋雞、雜交雞、蛋鴨和鵝也可能感染此病毒[13-15]，因此，HHS已成為危害我國養禽業的重大疾病之一，嚴重制約我國家禽產業的發展。

目前研究發現，FAdV-4主要侵害3～6周齡的肉雞，死亡率20%～100%[16]，感染該病的典型癥狀是心包內積有淡黃色的液體，肝臟腫大、有出血或壞死，腎臟腫大、蒼白[17]。感染該病后，肝臟是其主要的靶器官[18]，組織學上主要表現為肝細胞內可見核內包涵體[19]。HHS可通過水平和垂直兩種方式進行傳播，傳染性強[20]。近幾年國內外關于FAdV-4的研究較多，主要是致病性研究[18,21]和疫苗研制[22-23]，LI等[24]在FAdV-4山東分離株的致病性研究中，檢測接種后前幾日病理變化較為明顯的部分組織器官和泄殖腔棉拭子中的病毒載量。而全面系統的研究FAdV-4感染雞后，病毒在雞體內不同組織器官的分布規律以及雞的排泄規律的相對較少。

為了探索FAdV-4在雞體內發生發展的過程、趨勢及規律，本試驗以SPF雞為實驗動物，人工感染FAdV-4，通過RT-PCR跟蹤檢測感染后SPF雞組織器官的病毒載量和排毒情況，研究FAdV-4感染SPF雞體內組織的分布和排毒，分析其動態變化規律，為FAdV-4致病機理研究提供理論依據，并為FAdV-4的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株與SPF雞胚FAdV-4-GX2019-010毒株由本實驗室分離、鑒定、純化并保存；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑和儀器Universal Genomic DNA Kit購自北京康為世紀生物科技有限公司；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 購自Invitrogen公司；磷酸鹽緩沖物(PBS)、DMEM/F-12培養基購自Corning公司；胎牛血淸(FBS)購自Gibco公司；NanoDrop 2000、Applied Biosystems QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀購自ThermoFisher Scientific公司。

1.3 病毒的增殖取17～18日齡SPF雞胚，用75%的酒精消毒蛋殼表面，制備雞胚原什肝細胞(CEL)，置于37℃、5% CO2生化培養箱中培養，待其長成單層，取一定量病毒上清液接種細胞，培養并觀察2～3 d，待大部分細胞出現典型的細胞病變(CPE)，低速離心收集細胞并重懸于DMEM中，反復凍融，振蕩3次，于4℃、12 000 r/min離心5 min，收集病毒上清于液氮中保存備用。

1.4 病毒TCID50的測定將CEL在96孔細胞培養板培養至單層，10倍梯度稀釋，接種96孔細胞板，每個稀釋度重復6個孔，并設置陰性對照，連續觀察7 d，并記錄CPE，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50為10-7.2/mL。

1.5 人工感染SPF雞及樣品采集將100只3周齡SPF雞隨機分為2組：試驗組50只，對照組50只。試驗組的SPF雞以0.2 mL/只(TCID50=105.5/mL)的劑量通過滴鼻點眼接種病毒，對照組接種相同劑量的無菌PBS。每日觀察雞只精神狀態，于感染后1、2、3、4、5、6、7、10、14、21 d隨機抽取試驗組和對照組3只雞，采集咽喉拭子和泄殖腔拭子，放于1 mL含四抗(青霉素、鏈霉素、慶大霉素、制霉菌素)的PBS中，-80℃保存用于檢測SPF雞的排毒情況。剖殺并觀察病變情況，采集胸肌、肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腺胃、胰腺、法氏囊、腎臟、胸腺和腦，-80℃ 保存用于病毒載量的測定。

1.6 病毒DNA的提取及RT-PCR檢測組織和棉拭子樣品按照Universal Genomic DNA Kit說明書提取DNA，將提取的DNA標準化為100 mg/L，以此為模板進行RT-PCR。采用實驗室先前制備的陽性質粒，梯度稀釋制作標準品，RT-PCR擴增制作標準曲線。本試驗所用的檢測引物：5′-CACGAGCACCTCCAAAGA-3′；5′-TTGTACCCGTCGCAGA-GGAT-3′。反應體系：PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，RNase Free dH2O補足至20 μL。反應程序：50℃ 2 min;95℃ 2 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個循環；反應完成后進行融解曲線分析，每個樣品設3次重復。根據標準曲線和樣品Ct值，計算病毒載量。

2 結果

2.1 標準曲線的建立用NanoDrop 2000測定質粒濃度，經公式計算質粒的拷貝數為4.21×1010拷貝/μL，將質粒按照(4.21×103～4.21×107拷貝/μL)5個梯度稀釋，進行實時熒光定量PCR擴增，以標準品的拷貝數作為橫坐標，對應的Ct值作為縱坐標，制作標準曲線(圖1)，線性方程為y=-3.301x+38.095，斜率為-3.301，y軸截距為38.095，相關系數為1，表明線性很好。

圖1 標準品線性回歸曲線

2.2 SPF雞接種FAdV-4后組織器官病毒載量的動態分布通過RT-PCR檢測組織器官中FAdV-4的拷貝數(以對數值表示)，結果顯示所有的組織器官在感染后1 d便能夠檢測到病毒。在感染后1～21 d，病毒在不同組織器官中的分布和含量存在差異，但整體趨勢都是先增加后減少，感染后5～6 d達到最大值，其中肝臟、心臟和肺臟中病毒含量較高，肝臟中的病毒載量高達108拷貝/μL，表明肝臟是FAdV-4的主要靶器官;肺臟和心臟中的病毒載量約為106拷貝/μL。脾臟、胸腺、法氏囊3種免疫器官在感染后6 d達到最大值，病毒載量為104～106拷貝/μL。腺胃、胰腺和腎臟的病毒載量呈規律性變化，分別在在感染后5、6 d達到最大值，而后降低。與其他組織器官相比，肌肉和腦中的病毒載量較低，最大值僅為104拷貝/μL。在感染后6～21 d 組織器官中的病毒載量逐漸下降，在感染后21 d 組織器官中的病毒載量很低，小于100 拷貝/μL(圖2)，整個試驗過程對照組未檢到病毒。

圖2 FAdV-4感染SPF雞不同時間點各組織器官的病毒載量

2.3 SPF雞接種FAdV-4后體外排毒規律SPF雞感染后1～21 d咽喉和泄殖腔棉拭子中均可以連續檢測到病毒，咽喉中的排毒量波動不大，甚至在感染后14～21 d僅有微量排毒，主要通過泄殖腔排毒。咽喉和泄殖腔的整體排毒趨勢較為一致，在感染后6 d咽喉和泄殖腔的排毒均達到最大值，其中泄殖腔的病毒載量高達6.6×104拷貝/μL，感染6 d 以后排毒量開始下降，到21 d時排毒量很低(圖3),對照組棉拭子未檢測到病毒。

圖3 FAdV-4感染SPF雞的咽喉拭子和泄殖腔拭子的排毒情況

3 討論

近年來，FAdV-4在我國多個省份暴發，主要感染3～6周齡的肉雞[16]，病程多呈急性經過，死亡率可高達80%[25]，目前發現種雞、蛋雞和雜交雞也可感染該病[13]，也有少數報道鵝、鴨子、鵪鶉和鴛鴦也可感染此病毒[26-29]。前人研究發現，雞感染該病毒后可通過水平和垂直方式傳播[20]，傳染性很強，因此對其傳播途徑、傳播規律及感染動物體內分布的研究顯得尤為重要。

組織器官病毒載量的動態分析發現，SPF雞感染FAdV-4后，所有的組織器官均能夠連續的檢測到病毒，并且在感染后1 d，檢測到病毒，說明FAdV-4能迅速分布到雞組織器官中，甚至在感染后21 d，仍然能夠在SPF雞的各個組織器官中檢測到FAdV-4，說明FAdV-4可以在SPF雞體內持續存在較長時間。脾臟、胸腺和法氏囊3種免疫器官的病毒載量在攻毒后1～6 d呈上升趨勢，在第6天達到最高，病毒載量從高到低分別為脾(6.27)、法氏囊(5.31)、胸腺(5.12)。表明脾臟是抗感染免疫的主要免疫器官。感染后6 d正是病毒感染的高峰期，病毒迅速入侵免疫器官，并在免疫器官中增殖，使免疫器官受到侵害，免疫功能紊亂，進而容易激發或者并發其他細菌、真菌或其他病毒病，導致死亡，這可能是雞感染FAdV-4后具有較高死亡率的原因，與先前的研究結果一致[30]。本研究首次發現，FAdV-4存在于SPF雞的腦中，表明FAdV-4可以穿過血腦屏障，入侵腦并在腦中復制。但在試驗中并未觀察到SPF雞有明顯的神經癥狀，因此FAdV-4是否能夠穿過血腦屏障，破壞中樞神經系統需要更進一步的研究。此外，在肌肉中也有病毒的分布，表明FAdV-4可以在肌肉中復制，雖然病毒載量相對于其他組織器官較低，但是推測病毒的復制會破壞肌肉組織，從而導致雞感染后出現蜷縮、不愿移動等癥狀。本試驗中FAdV-4在SPF雞的各個組織器官中分布的部位和含量存在差異，但整體趨勢都是先上升后下降，相同時間點肝臟中的病毒含量要高于其他組織器官，說明肝臟是FAdV-4的主要靶器官，這與前人的研究結果一致[14,31]。在感染6 d以后組織器官的病毒載量持續降低，表明SPF雞體內的免疫作用對FAdV-4的增殖起到了抑制作用。試驗中所采集的組織器官參與了雞體內各大系統的運行，包括消化系統(腺胃、肝臟、胰腺)、呼吸系統(肺臟)、血液循環系統(心臟)、免疫系統(脾臟、胸腺、法氏囊)、神經系統(腦)、泌尿系統(腎臟)等，FAdV-4感染SPF雞后可入侵多個組織器官，從而影響機體的各項生命活動。

感染后FAdV-4 SPF雞的咽喉和泄殖腔均能夠連續檢測到病毒，表明SPF雞在感染后可通過呼吸道和泄殖腔這兩種方式進行排毒。感染后1 d在泄殖腔和咽喉拭子中可以檢測到病毒，咽喉中病毒的含量要比泄殖腔的含量高，推測與接種方式為滴鼻點眼有關。病毒在感染后1 d便能夠迅速通過呼吸道和泄殖腔排出體外，提示一些免疫學上的應用，宿主接種疫苗后，FAdV-4迅速排出體外，然后通過消化道和呼吸道進入雞體內，可以誘導雞的黏膜免疫系統(mucosal immune system,MIS)產生免疫反應，加強對宿主的免疫作用。在感染后5 d排毒量最高，排毒量與組織器官的病毒載量的變化趨勢相同。泄殖腔排出的病毒可以污染飲用水和飼料，從而使病毒通過糞口傳播。咽喉雖然檢測到的排毒量較低，但病毒可通過呼吸釋放到空氣中，通過呼吸道進行傳播。通過這些結果發現FAdV-4感染SPF后可通過呼吸道和泄殖腔釋放病毒，導致飼養環境被污染，推測這應該是該病毒傳染性較高的原因。直至試驗結束，試驗組的SPF雞仍然能夠通過呼吸道和泄殖腔排毒，因此應在本試驗基礎上適當延長排毒檢測的時間，掌握感染雞的排毒規律，有助于該疾病的防控。

本試驗將FAdV-4人工感染SPF雞，對感染后1～21 d SPF雞的咽喉、泄殖腔和各個組織器官中的病毒含量和分布進行全面系統的動態監測，發現病毒可以通過呼吸道和泄殖腔釋放病毒，其排毒量存在差異，泄殖腔的排毒量要高于呼吸道，但可以肯定的是，FAdV-4的廣泛感染與呼吸道和泄殖腔病毒的釋放密切相關，這也為預防該病的傳播提供了一個有效的措施。此外，在感染后21 d，剩余雞群已無明顯的臨床癥狀，但是仍然能夠檢測到病毒，表明耐過的雞群仍然攜帶病毒，這顯然增加了防控FAdV-4的難度。由于感染FAdV-4后SPF雞通過呼吸道和泄殖腔進行排毒，為病毒的水平傳播提供了良好的條件，這提示在生產中，暴發過FAdV-4的養禽場應做好全面的消毒，雞群不宜留作種用，防止病毒的垂直傳播。