豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和3型三重PCR檢測(cè)方法的建立

崔建濤,侯承堯,黨鈺茗,徐 通,趙 宇,田潤(rùn)博,陳紅英* (.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 45000；.河南泌陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，河南 泌陽(yáng) 463700)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科，可以感染各個(gè)年齡段豬，引起生長(zhǎng)豬呼吸系統(tǒng)疾病、妊娠母豬繁殖障礙、仔豬神經(jīng)癥狀并導(dǎo)致高死亡率，特別是15日齡內(nèi)仔豬，死亡率高達(dá)100%[1]。20世紀(jì)70年代，我國(guó)從匈牙利引入PRV弱毒疫苗Bartha-K61株，該疫苗在1990—2011年間廣泛應(yīng)用，有效控制了豬偽狂犬病在我國(guó)的流行。然而，2011年底，我國(guó)大部分地區(qū)包括接種Bartha-K61疫苗的豬群大規(guī)模暴發(fā)豬偽狂犬病，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

豬圓環(huán)病毒(porcine circovious,PCV)是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒，包括PCV1、PCV2和PCV3三種基因型，其中PCV1對(duì)豬群沒(méi)有致病性[3]，斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征主要由PCV2引起，同時(shí)也會(huì)侵害豬的淋巴系統(tǒng)，造成免疫抑制[4]。2016年，美國(guó)PALINSKI等[5]和PHAN等[6]幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)PCV3，PCV3與PCV密切相關(guān)，患病仔豬表現(xiàn)多方面功能紊亂，導(dǎo)致母豬死亡和流產(chǎn)。

由于PRV、PCV2和PCV3均可引起母豬繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)疾病，臨床上很難區(qū)分這3種病毒是單一感染還是混合感染，有報(bào)道稱PRV、PCV2與PCV3同時(shí)感染豬群時(shí)，臨床表現(xiàn)變得復(fù)雜且病豬死亡率增加[7-8]。本試驗(yàn)建立能夠同時(shí)檢測(cè)PRV、PCV2和PCV3的三重PCR方法，為這3種疾病的防控提供靈敏、特異和準(zhǔn)確的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株和臨床樣品PRV強(qiáng)毒株(PRV HN2012)、PCV2、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)均由鄭州市豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的病料樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，鑒定為PCV3陽(yáng)性病料樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。

2015年1月-2019年12月間，從河南、河北和山西等地多個(gè)豬場(chǎng)患有母豬繁殖障礙或/和呼吸系統(tǒng)疾病的豬中采集74份臨床組織樣品(包含心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)和腦)。

1.2 主要試劑病毒DNA快速純化試劑盒和凝膠回收試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；2×Ftaq PCR Master Mix購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；pMD18?-T載體、X-gal、IPTG、瓊脂糖等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成從GenBank中下載PRV gE基因序列(KF042383、KF017615、KF130880)、PCV2全基因(HQ395054、KX828217、MF616426)和PCV3全基因(KX778720、KX966193、MK340753)，利用Meg Align(DNA Star)軟件進(jìn)行同源性分析，找出高度保守區(qū)域。應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為PRV 429 bp、PCV2 273 bp和PCV3 344 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 三重PCR引物序列

1.4 病毒核酸的提取按照Trizol說(shuō)明書提取PRRSV、CSFV、PEDV和TGEV的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-80℃保存?zhèn)溆茫桓鶕?jù)病毒DNA快速純化試劑盒說(shuō)明書，分別進(jìn)行PRV、PCV2、PCV3和PPV的DNA提取，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PRV、PCV2和PCV3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備利用引物對(duì)PRVF/R、PCV2F/R和PCV3F/R分別進(jìn)行PRV、PCV2和PCV3單項(xiàng)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×Ftaq Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各為0.5 μL，模板量為1 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 5 min；94℃ 30 s、56℃ 25 s、72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體、構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-PRV、pMD18-PCV2和pMD18-PCV3，經(jīng)PCR鑒定、測(cè)序加以驗(yàn)證。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)3種陽(yáng)性質(zhì)粒濃度，分別計(jì)算其拷貝數(shù)。

1.6 PRV、PCV2和PCV3三重PCR的建立

1.6.1三重PCR方法反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過(guò)對(duì)退火溫度(52～62℃)、3種引物比例、DMSO的加入量進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的方法是控制變量法，在其他因素均保持不變的條件下，對(duì)某一因素的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定三重PCR的最佳反應(yīng)條件。

1.6.2三重PCR方法的特異性試驗(yàn) 應(yīng)用優(yōu)化后的三重PCR方法，以PRV、PCV2、PCV3、PPV、PRRSV、PEDV、TGEV、CSFV的DNA或cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)該方法的特異性。

1.6.3三重PCR方法的靈敏度試驗(yàn) 將構(gòu)建好的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-PRV、pMD18-PCV2和pMD18-PCV3等體積混合后進(jìn)行10倍系列稀釋，并將各個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板通過(guò)已優(yōu)化條件的三重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的靈敏度。

1.6.4三重PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)采自不同地區(qū)的同時(shí)感染PRV、PCV2和PCV3的5份陽(yáng)性病料樣品DNA進(jìn)行三重PCR檢測(cè)，并做3次重復(fù)。以確定該檢測(cè)方法的重復(fù)性與可靠性。

1.7 臨床樣品的檢測(cè)用建立的三重PCR方法檢測(cè)2015—2019年采自河南、河北和山西等地部分豬場(chǎng)患有母豬繁殖障礙或/和呼吸系統(tǒng)疾病的74份臨床組織樣品，并與單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法比較，以確定該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 三重PCR，雙重PCR及單項(xiàng) PCR擴(kuò)增結(jié)果及優(yōu)化通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件的優(yōu)化，最終確定三重PCR的反應(yīng)體系為25 μL。2×Ftaq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，DMSO 1 μL，PRV、PCV2和PCV3上、下游引物均為0.5 μL(25 μmol/L)，PRV、PCV2和PCV3的混合DNA為3 μL。三重PCR的反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 5 min；95℃ 30 s、56℃ 25 s、72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

單項(xiàng)PCR的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，分別在400、250和350 bp附近有1條特異性條帶(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。將回收的PCR產(chǎn)物分別連接到載體pMD18-T進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)的序列與GenBank上的參考序列比對(duì)，其同源性在98%以上，表明PCR產(chǎn)物為PRV、PCV2和PCV3的特異的目的片段。

M.DL2000 DNA Marker;1.PRV、PCV2和PCV3混合模板擴(kuò)增結(jié)果;2.PCV2和PCV3混合模板擴(kuò)增結(jié)果;3.PCV2和PRV混合模板擴(kuò)增結(jié)果;4.PCV3和PRV混合模板擴(kuò)增結(jié)果;5～7.PCV2、PCV3和PRV擴(kuò)增結(jié)果;8～14.陰性對(duì)照

2.2 三重PCR特異性結(jié)果以建立的三重PCR方法對(duì)PRV、PCV2、PCV3、PPV、PRRSV、PEDV、TGEV和CSFV核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，能擴(kuò)增出PRV的429 bp片段、PCV2的273 bp片段和PCV3的344 bp片段，而其他豬病原核酸以及陰性對(duì)照均無(wú)特異性條帶，表明該方法具有良好的特異性(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.PRV、PCV2和PCV3三重PCR擴(kuò)增結(jié)果;2～7.PEDV、TGEV、PRRSV、PPV、CSFV、E.coli擴(kuò)增結(jié)果;8、9.陰性對(duì)照

2.3 三重PCR靈敏度結(jié)果經(jīng)紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-PRV、pMD18-PCV2和pMD18-PCV3濃度，經(jīng)計(jì)算分別為1.25×1010、6.93×1011和9.12×1010拷貝/μL。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒等體積混合并進(jìn)行10倍稀釋后進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，PRV、PCV2和PCV3的最低檢測(cè)值分別為1 250.0，693.0和91.2拷貝/μL，表明該方法具有良好的靈敏性(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker;1～10.PRV、PCV2和PCV3混合質(zhì)粒稀釋10-1 ～10-10后擴(kuò)增結(jié)果；11.陰性對(duì)照

2.4 三重PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)已建立的三重PCR方法對(duì)采自不同地區(qū)同時(shí)感染PRV、PCV2和PCV3的5份陽(yáng)性病料樣品DNA進(jìn)行三重PCR檢測(cè)，并做3次重復(fù)，每次PCR擴(kuò)增結(jié)果均為PRV、PCV2和PCV3陽(yáng)性，陰性對(duì)照無(wú)條帶，表明該方法具有良好可重復(fù)性。

2.5 臨床診斷結(jié)果應(yīng)用建立的三重 PCR 方法，對(duì)74份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，三重PCR與單項(xiàng)PCR檢測(cè)符合率為100%，其中PRV、PCV2和PCV3各檢出22、53和43份，其檢出率分別為29.73%(22/74)、71.62%(53/74)和58.11%(43/74)(表2)，同時(shí)感染PRV和PCV2為19份，其檢出率為25.69%(19/74)，同時(shí)感染PRV和PCV3為16份，其檢出率為21.62%(16/74)，同時(shí)感染PCV2和PCV3為33份，其檢出率為44.59%(33/74)，同時(shí)感染PRV、PCV2和PCV3為12份，其檢出率為16.22%(12/74)，表明在患有母豬繁殖障礙或/和呼吸系統(tǒng)疾病的樣品中存在PRV、PCV2和PCV3(表2)。

表2 不同年份臨床樣品檢出率 %

3 討論

自2011年底以來(lái)，豬偽狂犬病的再次暴發(fā)已嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[2]。隨后，我國(guó)政府在2012年提出PRV根除計(jì)劃。自2013年后，PRV感染率持續(xù)下降[9]，但是目前豬偽狂犬病仍然在我國(guó)大多數(shù)省份流行，且各個(gè)地區(qū)PRV陽(yáng)性檢出率存在一定差異[10]。盡管有的地區(qū)PRV感染率處于較低水平，但是仍未達(dá)到根除。我國(guó)豬群中PCV2感染情況也不容樂(lè)觀，李婧雅等[11]對(duì)浙江地區(qū)的142份病料進(jìn)行PCR檢測(cè),其檢出率為56.3%,表明浙江地區(qū)的PCV2感染已相當(dāng)嚴(yán)重。自PCV3被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，PCV3在世界范圍內(nèi)逐漸流行，并在我國(guó)多個(gè)省份多個(gè)豬場(chǎng)存在[7-8,12]。此外，以前研究報(bào)道豬群中存在PRV、PCV2與PCV3同時(shí)感染[7-8]，且PRV、PCV2和PCV3都是豬場(chǎng)常見(jiàn)病原體，影響著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

多重PCR方法于1988年提出[13]，并用于混合感染的鑒別診斷，該方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和很好的應(yīng)用價(jià)值。多重PCR不僅具有單項(xiàng)PCR所具有的特異性和敏感性，還能縮短檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省試劑的用量。影響PCR擴(kuò)增效率的因素有很多，其中引物對(duì)于PCR擴(kuò)增的敏感性和特異性至關(guān)重要。本試驗(yàn)為確保PCR反應(yīng)的特異性，分別選擇了PRV的gE基因、PCV2和PCV3的Rep基因，并針對(duì)其保守序列設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性的引物，擴(kuò)增的目的片段大小分別為429、273和344 bp，相鄰病原體的片段大小相差約80 bp，具有一定的長(zhǎng)度梯度，凝膠電泳時(shí)能夠較直觀的區(qū)分不同的病原體。另外，PRV基因組G+C含量高達(dá)73%左右[14]，PCR中變性溫度較高，很難與其他病毒在同一條件進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，有研究表明PCR擴(kuò)增體系中加入DMSO，可顯著提高PCR擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增效率[15]，因此本研究在其反應(yīng)體系中加入適量DMSO，降低了核酸鏈的Tm值，使其容易變性，解決了因GC含量過(guò)高,不能正常擴(kuò)增出PRV野毒株gE基因的問(wèn)題，也不影響普通模板的擴(kuò)增，使反應(yīng)更容易進(jìn)行。

特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，只有PRV、PCV2和PCV3的三重PCR產(chǎn)物出現(xiàn)目的條帶，其他豬病原核酸(PPV、PRRSV、PEDV、TGEV、CSFV)均無(wú)條帶，表明該方法的特異性較高。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，PRV的最低檢測(cè)限為1 250拷貝/μL，與吳旭錦等[16]建立的PRV套式PCR方法靈敏度相當(dāng)。PCV2的最低檢測(cè)限為693拷貝/μL，與楊宗照等[17]所建立的多重PCR方法的靈敏度基本一致，PCV3的最低檢測(cè)限為91.2拷貝/μL，與徐朋麗等[18]所建立的普通PCR方法以及郝占武等[19]建立的PCV3 qPCR方法檢測(cè)下線相當(dāng)。試驗(yàn)結(jié)果還顯示該三重PCR方法重復(fù)性好，且與單項(xiàng)PCR檢測(cè)符合率為100%。表明所建立的三重PCR具有準(zhǔn)確、靈敏和特異特點(diǎn)，能為PRV、PCV2和PCV3的臨床診斷提供準(zhǔn)確和可靠的檢測(cè)結(jié)果。

本研究采用建立的三重PCR方法，對(duì)2015年-2019年河南、河北和山西等地部分豬場(chǎng)患有母豬繁殖障礙或/和呼吸系統(tǒng)疾病的74份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，PRV檢出率為29.73%，且2015、2016、2017、2018和2019年分別為30.00%、35.71%、28.57%、30.00%和25.00%，高于孫穎等[10]對(duì)2018年我國(guó)28個(gè)省、市、自治區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)各年齡段疑似豬偽狂犬病發(fā)病豬的1 328份組織樣品的PRV檢出率(6.93%)，這可能因?yàn)樵囼?yàn)的樣品量小，或者不同的試驗(yàn)組所使用的引物特異性不同而造成。PCV2和PCV3的檢出率分別為71.62%和58.11%，與徐朋麗等[20]報(bào)道的PCV2和PCV3檢出率相當(dāng)。2015、2016、2017、2018和2019年，PCV2檢出率分別為60.00%、57.14%、71.43%、75.00%和87.50%，PCV3檢出率分別為50.00%、57.14%、50.00%、60.00%和68.75%，可見(jiàn)PCV2和PCV3于2018年后呈現(xiàn)明顯增高的趨勢(shì)。此外，PRV和PCV2同時(shí)感染的檢出率是25.69%，PRV和PCV3同時(shí)感染的檢出率是21.62%，PCV2和PCV3同時(shí)感染的檢出率是44.59%，PRV、PCV2和PCV3同時(shí)感染的檢出率是16.22%。表明PRV陽(yáng)性率較高，PRV仍未達(dá)到根除，PCV2和PCV3的檢出率依然較高，且PRV、PCV2和PCV3之間雙重或三重混合感染也相當(dāng)嚴(yán)重，提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)PRV、PCV2和PCV3的臨床診斷和監(jiān)測(cè)。

隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，多種病原混合感染日益嚴(yán)重。PRV、PCV2和PCV3不僅能夠引起豬呼吸系統(tǒng)疾病，而且都能夠引起母豬繁殖障礙，危害嚴(yán)重，而臨床上很難區(qū)分是由PRV、PCV2或/和PCV3感染所引起的，因此，本試驗(yàn)建立了一種特異、靈敏和準(zhǔn)確的PRV、PCV2和PCV3三重PCR檢測(cè)方法，可達(dá)到單重PCR的檢測(cè)效果，而且極大地節(jié)約試驗(yàn)成本，更符合對(duì)疾病快速診斷的要求，降低了檢測(cè)工作者的任務(wù)量，為我國(guó)的PRV、PCV2和PCV3的監(jiān)測(cè)和防控提供技術(shù)保障。