豬瘟、非洲豬瘟和豬水泡病毒多重熒光RT-PCR同步檢測和鑒別診斷方法的建立及應用

史喜菊，劉艷華，馬貴平，李炎鑫，劉全國，賴平安，高志強，徐立偉 (北京海關，北京 100026)

我國自2018年發生非洲豬瘟疫情后，對活豬和豬肉制品的進口量劇增，為了保障進出口產品的安全性，出入境的活豬和豬肉制品都要經過嚴格檢疫。目前檢疫的主要豬病都是對養殖業危害巨大、OIE重點關注、世界各國重點防控的疫病[1-3]。現有檢測方法基本還是針對單個病原的單一檢測，會造成漏檢。而且，進境動物經過長途運輸后，在隔離檢疫期間可能會出現一些臨床疾病，很多病原都可以引起相似的臨床癥狀，現有單一檢測技術難以全面、真實地反映畜禽感染狀態和發病死亡原因[1-2]。因此，建立可同時檢測多重疾病的多重檢測技術一直是口岸和各級獸醫衛生防疫機構研究工作的重點。本試驗是在前期建立的多病原同步檢測技術基礎上[2-4]，進一步以古典豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)和豬水泡病病毒(swine vesicular disease virus，SVDV)為研究對象[2,5-10]，建立了可用于這3種病毒混合感染檢測和鑒別診斷的多重熒光PCR方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料CSFV、ASFV和SVDV陽性質控品均為本實驗室制備并保存的體外反轉錄cRNA或者重組質粒[2-3,9]。測試所用的CSFV、ASFV及豬圓環病毒2型(PCV2)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流感病毒(SIV)、O型口蹄疫滅活病毒(FMDV)和水泡性口炎病毒(VSV)均為本實驗室制備的核酸樣質控品[3]和檢測留樣。

1.2 試劑克隆載體和體外轉錄試劑均為Promega公司產品;Ex-Taq PCR試劑為TaKaRa公司產品;Path-IDTMMultiplex one-step RT-PCR Kit為AB公司產品；TIANamp Virus DNA/RNA Kit為天根生化公司產品；探針、引物由TaKaRa(大連寶生物)公司合成。

1.3 引物和探針設計與合成下載GenBank中現有CSFV、ASFV和SVDV所有分離株基因，使用CLCMain Workbench 7.0.3和BioEditor 1.6.1分析軟件進行多重比較，分別選取CSFV的5′UTR基因片段、ASFV的VP72基因片段和SVDV的5′UTR基因片段作為擴增靶基因，根據多重熒光RT-PCR特點分別設計并篩選出能覆蓋大部分分離株、又適合多重檢測并可以區分的引物和探針(表1)。引物和探針均由TaKaRa(大連寶生物)合成，用滅菌水稀釋成100 mmol/L儲藏液，-20℃保存備用。

1.5 多重熒光RT-PCR反應體系將引物和探針儲備液按照引物終濃度400 nmol/L和探針終濃度200 nmol/L的要求分別進行10倍稀釋和混合，引物混合液包括5條CSFV引物、5條ASFV引物和2條SVDV引物共12條，探針混合液包括2條CSFV探針、1條ASFV探針和1條SVDV探針共4條(表1)，按照表2配制反應體系，將混合液充分混合后，最后加入模板，簡短離心，按照表3的反應程序進行熒光PCR反應，所用設備為BioRad公司的CFX-96。

表1 CSFV、ASFV和SVDV的一步法多重熒光RT-PCR檢測引物

表2 一步法多重熒光PCR反應體系

表3 一步法多重熒光PCR反應程序

1.6 標準曲線繪制和最低檢測限的確定分別將已知濃度的CSFV、ASFV和SVDV陽性質控品進行10倍梯度稀釋后進行熒光RT-PCR反應，用模板濃度對數與對應的熒光Ct值做單重熒光RT-PCR濃度標準曲線，最高稀釋倍數能檢測出的Ct值所對應的濃度即為單重熒光RT-PCR最低檢測限。

再將已知濃度的CSFV、ASFV和SVDV陽性質控品等量混合后，進行10倍梯度稀釋進行多重熒光RT-PCR反應，按1.6步驟檢測最低檢測限。

1.7 特異性測試選擇實驗室制備的8種豬病毒質控品(表4)，分別用CSFV、ASFV和SVDV的引物和探針進行單重熒光RT-PCR，驗證引物和探針的特異性；用建立的多重熒光RT-PCR反應體系對表4中的8種病毒質控品進行檢測，驗證引物和探針混合后多重反應體系的特異性。

表4 特異性試驗用到的病毒質控品

1.8 多重熒光RT-PCR和單重熒光RT-PCR的比較將CSFV、ASFV和SVDV陽性質控品等量混合后進行10倍梯度稀釋，分別進行多重熒光RT-PCR和CSFV、ASFV和SVDV單重熒光RT-PCR，將相同濃度模板對應的熒光Ct值進行比較，求解回歸方程，比較多重熒光RT-PCR和各單重熒光RT-PCR的符合性。

1.9 樣品驗證和測試建立的多重熒光RT-PCR測試中國獸藥監察所豬瘟參考實驗室提供的CSFV核酸20份，委托美國農業部外來動物疫病中心(USDA)測試了ASFV毒株5株、各3個濃度梯度，與中國動物衛生與流行病學中心非洲豬瘟參考實驗室進行10份陽性樣品測試比對。對實驗室近2年收集的200份血液及300份肉制品提取病毒總核酸進行臨床樣品驗證，并與單重熒光RT-PCR進行比較。

2 結果

2.1 陽性質控品定量結果將制備好的陽性質控品，分別用紫外分光儀測定其D260和D280值并計算出質粒拷貝數(表5)。

2.2 標準曲線和最低檢測限分別用CSFV、ASFV和SVDV質控品做濃度標準曲線，結果如圖1。從圖1可以看出，標準曲線PCR擴增效率E值、R2和曲線斜率均在正常范圍內，說明擴增效率良好。將模板進行10-11稀釋仍能檢測到熒光信號，根據表5濃度，計算出對應的最低檢測限為8.8～13.0拷貝/μL。

表5 陽性質控品濃度測定

圖1 熒光RT-PCR標準曲線 A.CSFV；B.ASFV;C.SVDV

CSFV、ASFV和SVDV混合質控品做多重熒光RT-PCR標準曲線，從圖2可以看出，多重熒光RT-PCR擴增效率E值分別為103、107和110，R2值分別為0.984、0.986和0.989，曲線斜率均在正常范圍內，說明擴增效率并沒有受到多重干擾。相同稀釋倍數對應的Ct值比單重熒光RT-PCR略有升高，但不構成顯著性差異，最低檢測限仍然可達10拷貝/μL。

圖2 CSFV、ASFV和SVDV多重熒光RT-PCR標準曲線

2.3 特異性檢測結果單個病毒的引物和探針只能擴增出各自的病毒核酸，其他病毒模板擴增均為陰性，表明所設計的引物和探針特異性良好。利用建立的多重熒光RT-PCR方法對表4中的病毒進行檢測，結果僅CSFV、ASFV和SVDV有擴增曲線，其他病毒均無特異性擴增信號，表明所建立的方法特異性良好，多重并沒有對特異性產生干擾。

2.4 多重熒光RT-PCR和單重熒光RT-PCR的比較利用相同濃度的混合模板同時進行多重熒光RT-PCR和單重熒光RT-PCR的符合性測試，回歸方程計算結果表明，CSFV、ASFV和SVDV單重熒光RT-PCR與多重熒光RT-PCR的相關性系數R2分別為0.9988、0.9978和0.9976，說明多重熒光RT-PCR和各單重熒光RT-PCR的符合性良好，對于相同濃度的模板，其Ct值基本一致，所有引物和探針放在一個反應體系混合后并沒有相互干擾(圖3)。

圖3 多重熒光RT-PCR與單重熒光RT-PCR的比較

2.5 樣品驗證結果本研究建立的多重熒光RT-PCR對國家豬瘟參考實驗室提供的20份陽性樣品進行測試，100%符合。本檢測方法經USDA測試，5株ASFV毒株各3個濃度梯度，結果全部陽性；本實驗室檢測出的10份陽性樣品經與國家非洲豬瘟參考實驗室檢測，結果全部一致。從200份血液中檢測出ASFV陽性8份，從300份肉制品中檢測出ASFV陽性10份，CSFV和SVDV檢測均是陰性，與單重熒光RT-PCR檢測結果一致，沒有檢測到混合感染。

3 討論

針對單個病原檢測的熒光PCR技術目前已相當成熟，廣泛用于動物疫病檢測領域[9,11]，但是對于多重熒光PCR，由于對引物和探針設計的技術要求很高，目前并沒有成熟的方法可用。有很多學者已建立多種普通多重PCR檢測法[12]，而敏感性顯然不能滿足篩選試驗的要求[1,4,10,13-14]，也有研究建立多重熒光PCR，但敏感性和特異性沒有達到預期[8,13-17]。本研究針對目前單一病原檢測方法的不足，建立了CSFV、ASFV和SVDV 3種病毒一步法多重熒光RT-PCR檢測和鑒別方法。

現有熒光PCR大多是1個靶基因設計1對引物和1個探針，病毒靶基因經常容易發生變異，需要不斷更新引物和探針序列。本研究設計引物和探針時針對現有CSFV和ASFV序列，分別設計5條引物，基本可以覆蓋現有CSFV和ASFV分離株，針對CSFV還設計了2個探針，更增加了方法兼容性和涵蓋性。但是在同一個反應體系中混合多條引物和探針，互相之間的干擾又是一個難題，本研究從設計的眾多序列中進行配對篩選，經過RNA-RNA引物二級結構等測試和篩選，最終選擇了上述序列。

通過濃度熒光標準曲線可以看到，不論是單重熒光RT-PCR還是多重熒光RT-PCR，其標準曲線顯示PCR擴增效率E值均在正常范圍，R2>0.98,曲線斜率也正常，說明擴增效率很高，體系中各成分濃度搭配恰當。

敏感性測試結果表明，與各病原單重熒光RT-PCR相比，對于相同濃度的模板，多重熒光RT-PCR擴增所得Ct值略有升高，但差異不顯著，計算所得最低檢測限仍然可達10拷貝/μL，與之前的熒光PCR技術的敏感性指標一致[2,17-18]。

特異性測試結果表明，本研究建立的多重熒光RT-PCR引物和探針特異性均為100%，不管是單病原模板，還是3個病原混合模板，單特異性引物和探針和多重混合引物和探針均只能擴增出自己的目標病原。而且，用實驗室建立的其他8種豬病毒陽性質控品測試，均未見任何非特異性擴增。說明上述設計的15條引物和4個探針放在同一個多重反應體系并沒有產生干擾，特異性很強，克服了多重PCR的固有不足[12]。

多重熒光RT-PCR與單重熒光RT-PCR比較分析表明，對于同一濃度模板，多重熒光RT-PCR分別與各自單重熒光RT-PCR擴增得到的Ct值相關性非常高，R2均大于0.99，再次證明了引物和探針的混合并沒有產生相互干擾，沒有影響擴增效率。據報道，三重熒光PCR可以達到與單重熒光PCR相等的指標參數，但是四重以后敏感性和特異性均會受到不同程度的影響[2，12,17]。本研究也曾嘗試加入第4種病原，四重熒光RT-PCR標準曲線指標參數很難都落在合理范圍內(未公開發表)，說明產生了干擾，敏感性會降低。

在方法驗證過程中，本研究建立的多重熒光RT-PCR方法用國家豬瘟參考實驗室提供的20份CSFV核酸樣品進行驗證，100%符合。USDA測試的樣品包括5株ASFV毒株，每個毒株設了3個不同濃度梯度，結果均為陽性。本次檢測的10份陽性樣品送到國家非洲豬瘟參考實驗室確診，結果完全相同。在臨床樣品測試中，分別使用了200份血液和300份豬肉制品，篩選出ASFV陽性樣品8份(8/200)和10份(10/300)，這與前2年我國ASF疫情暴發有關，有的動物也許處于隱性感染或者康復帶毒狀態。CSFV和ASFV臨床癥狀相似，在感染野豬群中也發現了2種病原可以共存[6]，但本研究沒有檢測到共感染樣品。一方面說明CSFV得到了很好的控制，另一方面可能也與采樣部位有關，CSFV常見于各種淋巴組織和處于病毒血癥期的血液中[6,11,13]，而SVDV很多年在我國并未見報道。