E種腸道病毒HY12毒株非結構蛋白3C單克隆抗體的制備與鑒定

蔡夢露，章 凡，宋亞偉，王瑋玉，王浴光，董 坤，王新平 (吉林大學 動物醫學學院 教育部人獸共患病研究重點實驗室，吉林 長春 130062)

牛腸道病毒感染是由牛腸道病毒(bovine Enterovirus,BEV)引起的一種臨床上以消化道和呼吸道癥狀為主要特征的傳染病。牛群感染該病毒后常表現為發熱、咳嗽、呼吸困難、腹瀉等癥狀，嚴重者甚至出現突然死亡[1]。根據病毒最新分類，腸道病毒屬分為12個腸道病毒種和3個鼻病毒種，其中，E、F以及G種腸道病毒的感染均能夠給畜牧業的發展造成嚴重危害[2]。1959年，MOLL等[3]首次報道了BEV感染的病例，隨后BEV感染在世界許多國家發生和流行[4-5]。本實驗室于2012年從吉林省某牛場的病牛體內分離到了國內首株E種腸道病毒，并通過分子生物克隆技術獲得其全基因組序列[6]。

腸道病毒是呈二十面體對稱且無囊膜包裹的單股、正鏈RNA病毒，其全基因組長度約為7.5 kb，包含1個大的開放閱讀框(ORF)，可翻譯出1個前體多聚蛋白[7-8]。翻譯出的多聚蛋白在蛋白水解酶的裂解作用下，可被水解為前體蛋白P1、P2和P3。前體蛋白P1又可經水解作用加工形成病毒衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，它們負責病毒的進入、包殼以及病毒粒子的組裝。前體蛋白P2和P3可水解生成7種非結構蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，具有參與病毒翻譯和復制，促進細胞凋亡等作用[9-12]。其中，非結構蛋白3C約包含184個氨基酸，是腸道病毒中不可缺少的蛋白酶，可裂解前體蛋白P2和P3生成其他非結構蛋白；同時，3C具有RNA結合活性，可抑制宿主體內的Ⅰ型干擾素反應從而干擾宿主的天然免疫，在病毒復制以及誘導宿主細胞凋亡的過程中都扮演著重要的角色[13-14]。

由于BEV感染為國內新發傳染病，現在對此病尚無有效的免疫制劑進行預防，也無有效的藥物用于臨床治療；同時，有關該病毒各蛋白功能及致病機理等方面尚缺乏深入研究[6]。因此，本研究以HY12毒株非結構蛋白3C作為研究對象，制備其單克隆抗體，為今后探究BEV非結構蛋白3C的功能及其作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑Trizol試劑、反轉錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、BamHⅠ和SalⅠ限制性內切酶、T4DNA連接酶、DL2000 DNA Marker和DL5000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自北京聚合美生物有限公司；Protein Marker購自北京全式金生物技術有限公司；氨芐青霉素(Amp)、瓊脂糖、IPTG誘導劑以及SDS-PAGE凝膠電泳相關試劑均購自寶泰克生物公司；弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑、PEG4000、HRP標記羊抗鼠IgG購自Sigma公司；RMPI1640購自Gibco；96孔培養板及其他用于細胞培養的耗材、酶標板均購自Corning；FBS胎牛血清購自海克隆生物化學制品有限公司；鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Sino Biological公司；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物、病毒、細胞及菌株SPF級BALB/c小鼠購自遼寧長生生物制品研究所；BEV HY12毒株是本實驗室從吉林省某牛場發病牛體內分離得到，通過分子生物克隆技術獲得其全基因組序列并經過分析，確定為國內首株E種腸道病毒，于-80℃ 凍存備用；Vero細胞、SP2/0骨髓瘤細胞均為本實驗室凍存；Top10感受態細胞、BL21感受態細胞均為本實驗室制備，保存于-80℃備用；pGEX-4T-1原核表達載體為本實驗室凍存。

1.3 病毒的培養將Vero細胞置于37℃、5% CO2培養箱內，用含有5%胎牛血清的DMEM培養。待細胞生長至80%左右，接種適量的BEV HY12病毒液并搖晃均勻，放置于培養箱中培養，每隔4～6 h觀察1次，待30%～40%的細胞出現細胞病變(CPE)時提取細胞總RNA。

1.4 細胞總RNA的提取將出現病變的細胞棄掉培養液置于冰上，加入600 μL Trizol試劑，輕輕晃動培養皿以充分裂解細胞，將裂解細胞刮下置于1.5 mL EP管中；向管中加入350 μL氯仿，顛倒混勻后于4℃ 12 000 r/min，離心10 min。將上層透明上清吸出，加入等體積的異丙醇(或2倍體積的無水乙醇)輕輕上下顛倒混勻后，4℃，12 000 r/min，離心10 min。棄掉上清，用75%的乙醇洗滌沉淀塊2～3次，瞬時離心并盡量去除管底殘余液體，置于冰盒上開蓋晾干，最后溶于無RNase的H2O中，測定濃度后置于-80℃中保存備用。

1.5 目的基因的合成應用反轉錄試劑盒，以提取的總RNA作為模板合成病毒的cDNA。參照BEV HY12毒株的全基因組核苷酸序列，選取非結構蛋白3C序列中免疫原性較好且無信號肽干擾的一段序列設計合成引物，并在引物的5′端和3′端分別插入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點。利用PCR技術，以cDNA為模板擴增出目的片段，應用1%瓊脂糖凝膠電泳來驗證目的片段的擴增結果。

1.6 重組質粒的構建將目的片段和原核表達載體pGEX-4T-1分別用BamHⅠ和SalⅠ限制性內切酶進行雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收酶切好的目的片段和表達載體。按照合適的比例把回收的目的片段連接到表達載體pGEX-4T-1的BamHⅠ/SalⅠ酶切位點上，連接產物轉化Top10感受態細胞，冰浴30 min后在42℃水浴鍋中熱激1 min，再冰浴3 min后加入1 mL無抗性的LB液體培養基，置于37℃搖床中振蕩培養45 min后，10 000 r/min離心1 min。棄上清，用100 μL LB液體培養基重懸細菌沉淀并均勻涂布于含有Amp抗性的LB瓊脂平板上，倒置于37℃溫箱中培養12 h。待平板上長出菌落后，挑取瓊脂平板上的單個菌落進行擴增培養，抽提質粒，用BamHⅠ/SalⅠ限制性內切酶進行酶切驗證，經驗證連接成功的重組質粒命名為pGEX-4T-1-3C，并送由上海生工生物有限公司測序。

1.7 重組蛋白的表達及純化將鑒定成功的陽性重組質粒pGEX-4T-1-3C轉化到BL21感受態細胞中，涂板后倒置于37℃溫箱中培養,12 h后，挑取板上單個菌落置于含有Amp抗性的200 mL LB液體培養基中擴增培養。待細菌處于對數生長期時，加入1.0 mmol/L的IPTG誘導劑于37℃中誘導表達。3 h后，離心收集菌體并溶解于適量的PBS緩沖液中，10 000 r/min，離心10min，洗滌3次后置于-80℃反復凍融3次。將凍融好的菌液放置于冰上進行超聲裂解20 min，裂解后于4℃，10 000 r/min，離心10 min。收集上清和沉淀后，用1.5 mol/L的尿素溶解沉淀，于4℃的環境下靜置15 min后再次離心，反復3次，最后用8 mol/L的尿素溶解沉淀并分裝，凍存于-80℃保存備用。

1.8 SDS-PAGE凝膠電泳將獲得的上清和沉淀分別進行SDS-PAGE凝膠電泳后，用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色30 min，倒掉染色液后加入考馬斯亮藍脫色液進行脫色處理。根據凝膠上呈現的結果，驗證目的蛋白的表達、大小等情況是否與預期一致以及觀察蛋白的純化效果。

1.9 免疫動物及單克隆抗體的制備將純化好的pGEX-4T-1-3C重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積乳化混合后，于6周齡的BALB/c小鼠腹部皮下進行多點注射，保證每只小鼠注射100 μg蛋白。14 d后再次取重組蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，以相同的免疫劑量和免疫途徑對小鼠分別進行第2次和第3次免疫；第3次免疫后7 d，對小鼠進行尾部靜脈采血，應用間接ELISA方法檢測免疫小鼠的血清抗體效價。當小鼠的血清效價高于104時，取100 μg蛋白直接注射于小鼠腹腔內進行沖擊免疫。3～5 d后，即可對其進行眼球采血收集血清，作為鼠源抗3C蛋白多克隆抗體，并在無菌條件下采集其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按照適當的比例(一般1∶4～10)進行融合。在進行融合前的1～2 d 內，還需采集未免疫、健康小鼠的腹腔巨噬細胞作為飼養層細胞，為雜交瘤細胞提供細胞生長因子以及發揮吞噬衰老細胞和微生物的作用。

1.10 雜交瘤細胞的篩選定期對融合后的雜交瘤細胞進行觀察，并在融合后5 d進行第1次半換液，此后每隔3～5 d換液1次。待雜交瘤細胞長至96孔培養板單孔面積的50%左右，應用間接ELISA方法檢測其細胞上清中的抗體效價。將其D490的檢測值與陰、陽性對照進行比較，篩選出D490值較高的陽性細胞孔進行后續的亞克隆試驗。通過有限稀釋法至少進行3次亞克隆，直到篩選出能夠穩定分泌HY12非結構蛋白3C抗體的單克隆雜交瘤細胞株；并對其進行擴大培養和凍存，以備后續應用。

1.11 單克隆抗體的亞型鑒定應用Sino Biological公司生產的鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對本單克隆抗體進行亞型鑒定。根據此產品說明書進行間接ELISA試驗，即以不同亞型的抗體作為包被抗原，雜交瘤細胞上清作為一抗，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG作為二抗，顯色后借助酶標儀判定D450值。

1.12 單克隆抗體反應原性的鑒定以免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)對本單克隆抗體的反應原性進行鑒定。用適量的HY12毒株病毒液感染Vero細胞；待接毒細胞出現30%～40%的病變后，棄去培養液，加入丙酮/甲醇(1∶1)混合物置于-20℃環境下固定20 min。棄掉液體，加入5%的脫脂奶粉于37℃溫箱封閉1 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；洗滌結束后，以陽性雜交瘤細胞的培養上清作為一抗在37℃溫箱中孵育1 h；用PBST緩沖液按相同方式洗滌后，以HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗置于37℃溫箱中孵育45 min；PBST緩沖液洗滌后，使用AEC底物顯色液于37℃避光顯色5～10 min，棄去顯色液后用顯微鏡進行觀察。

1.13 單克隆抗體特異性的鑒定同時以GST蛋白和HY12-3C蛋白作為抗原包被ELISA酶標板，以陽性雜交瘤細胞上清作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗進行間接ELISA檢測，根據ELISA檢測結果來評價本單克隆抗體的特異性。

2 結果

2.1 重組質粒pGEX-4T-1-3C的構建及鑒定以BEV HY12毒株病毒液感染Vero細胞后，用TRIzol法提取細胞總RNA并經反轉錄取得cDNA，以cDNA作為模板應用PCR方法擴增出HY12-3C的目的片段。如圖1所示，擴增出了與預期大小相符的目的片段，約為552 bp。將擴增得到的目的片段插入到pGEX-4T-1原核表達載體中，轉化Top10感受態細胞，挑取單菌落擴增培養，抽提質粒，并用BamHⅠ/SalⅠ限制性內切酶進行酶切驗證。如圖2所示，雙酶切后獲得與預期大小相一致的目的片段和原核表達載體，表明成功構建了pGEX-4T-1-3C重組質粒。經核苷酸序列測定顯示，所插入的由HY12-3C氨基酸序列與原核表達載體中的GST序列處于同一讀碼框架中，且未發生讀碼移位和突變現象。

M.DL5000 DNA Marker;1,2.PCR擴增3C基因片段的電泳結果

M.DL5000 DNA Marker;1.pGEX-4T-1-3C質粒對照；2.pGEX-4T-1-3C單酶切；3.pGEX-4T-1-3C雙酶切

2.2 重組蛋白的表達與純化將構建成功的重組質粒pGEX-4T-1-3C轉化到BL21感受態細胞中，挑取單菌落后置于含有Amp抗性的LB液體培養基里擴增培養；待細菌生長至對數生長期時，加入1.0 mmol/L 的IPTG誘導劑進行誘導表達，并應用包涵體純化法對誘導表達的蛋白進行純化。經SDS-PAGE凝膠電泳，用考馬斯亮藍染色液和脫色液進行染色和脫色處理后，從凝膠上呈現的結果可以看出：加入IPTG誘導劑誘導表達的菌液表達出了與預期大小相符的蛋白，大約為46 kDa；并且對表達蛋白進行純化后獲得了1條較為明顯的單一條帶，表明蛋白純化效果良好且表達的蛋白大部分來自于包涵體中(圖3)。

M.蛋白Marker;1.未加IPTG誘導;2.IPTG誘導的3C重組蛋白;3.純化后的上清;4.純化后的包涵體

2.3 血清效價的檢測小鼠經過3次腹部皮下免疫后，從其尾部靜脈采血并收集血清，對血清進行倍比稀釋后作為一抗，二抗選用HRP標記的羊抗鼠IgG，應用間接ELISA方法測定小鼠血清中的抗體效價。結果如圖4所示，小鼠免疫前的陰性血清D490平均值為0.075；經3C蛋白免疫過的小鼠其血清稀釋倍數達到1.6×104時，相應的D490值仍高于陰性血清的2倍。此時可采集小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合制備鼠源抗3C蛋白單克隆抗體。

圖4 BALB/c小鼠第3次免疫后血清抗體效價檢測結果

2.4 雜交瘤細胞的制備選取效價高的小鼠與骨髓瘤細胞進行融合。經觀察，本次試驗的融合率大約為50%，陽性率達10%。從篩出的陽性細胞孔中選擇了2株D490值較高的細胞株進行3次亞克隆，最終獲得1株能夠穩定分泌3C抗體的雜交瘤細胞株，并將其命名為3C9。

2.5 抗體亞型鑒定根據Sino Biological公司的鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒的鑒定結果得出，本試驗中獲得1株單克隆抗體3C9其抗體亞型為IgM。

2.6 抗體反應原性檢測應用IPMA試驗對制備的3C單克隆抗體進行反應原性測定。根據結果可觀察到(圖5)，與陰性對照和陽性對照相比，本研究制備的3C單克隆抗體可特異性地識別出腸道病毒HY12毒株感染細胞中的病毒抗原，表明本研究制備的單克隆抗體具有良好的特異性。

A.鼠源抗3C蛋白單克隆抗體孵育的腸道病毒HY12感染細胞;B.鼠源抗3C單克隆抗體孵育的未接毒細胞;C.陽性對照;D.陰性對照

2.7 抗體特異性檢測分別以GST標簽蛋白和HY12-3C蛋白作為包被抗原的間接ELISA檢測結果顯示，本試驗獲得的單克隆抗體僅與HY12-3C產生特異性反應，而與GST標簽蛋白未發生任何免疫反應，表明本試驗所制備的單克隆抗體具備較好的反應特異性。

3 討論

BEV系小RNA病毒科腸道病毒的成員，在臨床上可引起牛的以呼吸系統、消化系統和神經系統為主要癥狀的疾病。BEV感染作為國內外新發動物傳染病，在牛群中的感染率較高，且常與其他病原體一起造成混合感染或繼發感染，給養牛業帶來了嚴重的經濟損失[15]。BEV自1959年首次報道后，相繼在國內外的許多地區發生和流行，并且該病的流行正呈現出逐步擴大的態勢[3,16]。目前，臨床上針對BEV的感染尚無有效的藥物和疫苗進行防治，對該病毒的致病機理及各蛋白的功能等方面也缺乏進一步的研究[6]。

2012年本實驗室從吉林地區某牛場病牛體內分離到首株E種腸道病毒HY12并獲得了其全基因組序列[6]。本實驗室邢澤黎等[17]、劉丹等[18]分別制備了E種腸道病毒結構蛋白VP1和VP2的單克隆抗體，為進一步研究腸道病毒結構蛋白的生理學特性和蛋白功能、建立腸道病毒檢測方法等奠定了前期基礎。同時，腸道病毒的非結構蛋白在病毒的致病過程中也發揮了及其重要的作用，尤其是非結構蛋白3C。因此，本試驗通過合成HY12毒株非結構蛋白3C的特異性引物，應用PCR方法擴增出目的片段，并將其克隆到pGEX-4T-1原核表達載體上，使其誘導表達出高效的重組蛋白，以此作為抗原免疫小鼠獲得特異性良好的抗3C蛋白單克隆抗體。該單克隆抗體特異性良好，為進一步建立診斷BEV感染的方法打下基礎，為研究3C蛋白的生物學特性和功能奠定基礎。

因大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清晰、便于操作、表達量高、產物穩定性較好、適用范圍廣及成本低等優點被廣泛應用于基因蛋白表達[19]。本試驗在使用大腸桿菌表達系統表達蛋白的過程中，摸索到的最佳表達條件是加入1.0 mmol/L的IPTG誘導劑在37℃環境下誘導表達3 h[20]。對誘導表達的蛋白超聲裂解后進行了蛋白可溶性分析，結果表明該重組蛋白主要以包涵體的形式存在。包涵體表達的蛋白質沒有活性，在之后的細胞裂解和蛋白純化步驟中不用擔心蛋白質是否失活；同時以包涵體形式表達的蛋白相較其他形式的蛋白在分離和純化方面操作更為簡便且成本低廉。使用包涵體純化法對本蛋白進行純化后用1.5 mol/L的尿素進行洗滌，最后溶解于8 mol/L的尿素中分裝凍存備用。通過SDS-PAGE凝膠電泳的鑒定結果，顯示該蛋白的大小與預期大小一致并且純化效果良好。將重組蛋白與弗式佐劑乳化混合后分3次免疫BALB/c小鼠，待免疫小鼠血清效價達到104以上時即可采集小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合制備抗3C單克隆抗體。IPMA試驗，即免疫過氧化物酶單層細胞試驗，是免疫學上常用于檢測病毒感染的試驗之一，具有較好的特異性和較強的敏感性，且可以更為直觀的觀察到病毒對細胞的致病變作用。在IPMA試驗中，用BEV HY12毒株感染Vero細胞，以3C雜交瘤細胞培養上清作為一抗，結果證明本試驗制備的鼠源抗3C單克隆抗體可特異性地識別到病毒抗原，且該單克隆抗體特異性良好。

綜上所述，本試驗成功制備了特異性和反應原性較好的抗3C單克隆抗體，為進一步研究BEV非結構蛋白的功能、開發治療藥物和疫苗奠定了基礎。