羊傳染性膿皰病毒通過激活PI3K/Akt通路抑制HeLa細胞凋亡

呂麗君，黃后雙，2，關繼羽，周艷龍，王 帥，賀文琦，宋德光，高 豐，趙 魁* (.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 30062；2.深圳市藥品檢驗研究院，廣東 深圳 58057)

羊傳染性膿皰病毒(Orf virus,ORFV)為痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)成員，具有高度的嗜上皮性，主要引起感染綿羊、山羊的局部性皮膚損傷病變[1-2]。通過與病羊的直接/間接接觸，人(尤其是牧民、屠夫、獸醫)也可發生感染，成為影響我國乃至世界公共衛生安全的一個重要隱患[3-4]。目前，ORFV感染廣泛分布于世界各地，在我國以東北、西北等主要養羊省區羊群中發生較為嚴重，是嚴重危害養羊業發展的重要動物疫病之一。盡管該病臨床上具有自限性和低死亡率的特點，但在羔羊、兒童和免疫抑制動物，死亡率可高達80%[5]。

細胞凋亡是宿主細胞對抗病毒感染等多種外界刺激所做出的重要防御手段之一，通過誘導感染細胞凋亡從而有效阻止病毒對鄰近細胞的感染，進而抑制病毒的復制和傳播[6-7]。然而，作為大型DNA病毒，痘病毒自身能夠復制編碼一系列抗凋亡基因抑制感染細胞的凋亡[8]，例如，ORFV ORF125基因被發現含有與Bcl-2家族成員相同的保守序列，編碼蛋白具有類似Bcl-2的抗凋亡活性[9]。ORFV ORF119蛋白C端存在視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)結合基序“LxCxE”，可通過與pRb家族成員的結合，進而參與對細胞周期、細胞凋亡等通路的調控[10]。

近年來，越來越多的研究表明，多種病毒可激活宿主細胞PI3K/Akt等抗凋亡通路，通過抑制細胞凋亡從而有助于病毒完成生命周期[11]。例如，單純皰疹病毒1(herpes simplex virus,HSV-1)能夠激活與凋亡阻斷相關的PI3K/Akt信號通路，促進病毒基因的表達[12]。乙肝病毒表面抗原(HBxAg)可通過激活PI3K/Akt通路抑制人胎盤滋養層細胞凋亡[13]。雞傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)通過其VP5蛋白與PI3K的p85α亞基相互作用，激活PI3K/Akt信號通路，抑制感染早期細胞的凋亡，進而促進病毒增殖[14]。腸道病毒71型(entero virus 71,EV71)也可通過激活 PI3K/Akt 通路抑制JNK介導的細胞凋亡[15]。然而，在ORFV感染過程中，PI3K/Akt信號通路與細胞凋亡的相互關系尚不明確。鑒于此，本研究運用Western blot、免疫熒光技術、流式細胞術、藥物阻斷等方法，系統研究ORFV感染對PI3K/Akt通路和細胞凋亡的影響，以及PI3K/Akt通路介導ORFV感染HeLa細胞凋亡抑制的途徑。該研究不僅有助于加深對ORFV抑制感染細胞凋亡機制的了解，而且將為ORFV免疫逃逸機制的全面解析以及疾病防控提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒羊傳染性膿皰病毒(ORFV/JL/08/CC)由本實驗室分離鑒定保存[16]，HeLa細胞由本實驗室保存。

1.2 抗體和試劑PI3K抑制劑LY294002購自Calbiochem公司；Akt、磷酸化Akt(Ser473)和β-actin抗體均購自CST公司；MDM2、GSK3β和Bad抗體均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自Proteintech公司；MEM培養基和胎牛血清均購自GIBCO公司；MTT購自Sigma公司；annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京全式金生物。

1.3 細胞增殖試驗利用MTT法測定細胞增殖能力，將96孔板細胞用不同濃度(10～50 μmol/L)的PI3K抑制劑LY294002處理48 h后，每孔加入MTT試劑使終質量濃度為0.5 g/L，37 ℃、5% CO2孵育4 h；去除培養基，加入DMSO(100 μL/孔)搖板孵育10 min。使用酶標儀(BioRad,Hercules,CA)測定活細胞在570 nm波長下的吸光度。

1.4 病毒感染與藥物處理經PI3K抑制劑LY294002(25 μmol/L)預處理1 h后的Hela細胞，以MOI=1接種ORFV，或以等體積的MEM作為對照，吸附1 h后，加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養。

1.5 免疫熒光分析使用annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，按照說明書對細胞進行凋亡檢測；染核：細胞經PBS洗滌3次后，用預冷的甲醇和丙酮(1∶1)固定10 min，與Hoechst(0.5 g/L)溶液共孵育10 min，再次洗滌后，使用倒置熒光顯微鏡(Leica DM18,Germany)觀察細胞。

1.6 流式細胞術檢測將細胞按1.4方法處理后，用胰蛋白酶消化收集并重懸于annexin V結合緩沖液中，使細胞濃度為1×106個/mL。取100 μL細胞懸液(105個細胞)與annexin V-FITC(0.1 g/mL)混合室溫孵育15 min后，使用500 μL結合緩沖液重懸并與10 μL的PI(30 g/mL)溶液4 ℃避光染色。利用BD FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測annexin V-FITC熒光，每個樣本至少分析30 000個細胞。

1.7 Western blot檢測將細胞按1.4方法處理后，使用含有1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液收集樣品，經10% SDS-PAGE電泳結束后轉移到PVDF膜。含5%脫脂奶的TBST(0.1% 吐溫20)溶液37℃封閉1 h后，分別用Akt、p-Akt(Ser473)、MDM2、GSK-3β和β-actin抗體4℃孵育過夜，洗膜后進行HRP標記二抗孵育、ECL顯色，并利用Image J軟件對蛋白進行定量。

1.8 統計學分析通過SPSSV 17.0軟件對結果進行t檢驗分析(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ORFV感染誘導依賴PI3K的Akt磷酸化Western blot檢測ORFV感染Hela細胞后Akt和p-Akt的表達情況。結果顯示，ORFV感染組中p-Akt(Ser 473)水平在3～48 h間先增加后減少，48 h 后p-Akt的水平與對照組細胞同一時間點的表達相似(圖1A)。由于Akt是PI3K信號通路下游的主要效應分子，因此，進一步探究ORFV感染中Akt的活化是否通過PI3K信號通路實現。將ORFV接種于經PI3K特異性抑制劑LY294002(25 μmol/L)預處理1 h的HeLa細胞，吸附1 h后加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養，收集感染后的細胞裂解液，Western blot檢測p-Akt水平。結果顯示，經LY294002處理Akt的總蛋白水平未發生明顯改變，但能夠抑制Akt的磷酸化(圖1B)。該結果表明，ORFV 感染Hela 細胞能夠激活依賴PI3K的Akt磷酸化。此外，MTT法檢測結果顯示，LY294002濃度達40 μmol/L時對Hela細胞增殖具有顯著影響(圖2)。

A.ORFV感染Hela細胞誘導Akt發生磷酸化；B.ORFV感染Hela細胞誘導依賴PI3K的Akt磷酸化

圖2 MTT法檢測PI3K特異性抑制劑LY294002對Hela細胞活性的影響

2.2 ORFV感染通過PI3K/Akt信號通路抑制Hela細胞凋亡將ORFV接種于Hela細胞，并以等量MEM作為對照，48 h后使用細胞核染色劑Hoechst 33258和Annexin V-FITC/PI 對細胞進行染色。熒光顯微鏡觀察發現，在ORFV感染組中，Hela細胞核完整，未出現染色質濃縮、分割或邊緣化，細胞膜發生裂解成塊狀等典型的凋亡狀態，Annexin V未出現特異性染色，與對照組一致(圖3A)，表明ORFV感染未引起Hela細胞發生凋亡。將ORFV接種于經PI3K特異性抑制劑LY294002(25 μmol/L)預處理1 h的Hela細胞，吸附1 h后加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養，并以等量DMSO作為對照，48 h后使用Hoechst 33258和Annexin V-FITC/PI 對細胞進行染色。結果顯示，與DMSO對照組相比，LY294002處理組Hela細胞核出現藍色濃斑顆粒狀光、體積變小，細胞質濃縮，Annexin V-FITC標記綠色熒光增多，同時PI也使細胞核發生了彌散性的紅染(圖3B)，表明經LY294002預處理抑制PI3K/Akt信號通路后，ORFV感染誘導Hela細胞發生凋亡。上述結果表明，PI3K/Akt 信號通路在ORFV感染Hela細胞的凋亡抑制過程中起著重要作用。此外，將ORFV接種于經PI3K特異性抑制劑LY294002(25 μmol/L)預處理1 h的Hela細胞，吸附1 h后加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養，并以等量ORFV單獨接種作為對照，使用Annexin V-FITC/PI雙標試劑盒對LY294002和ORFV共培養24、48 h的Hela細胞進行染色標記，利用流式細胞儀檢測凋亡情況。結果顯示，與ORFV感染組相比，LY294002處理組細胞凋亡率明顯增高，凋亡細胞數量顯著增多(圖4A,B)。綜上所述，ORFV感染通過激活PI3K/Akt信號通路抑制Hela細胞凋亡。

A.ORFV感染Hela細胞；B.ORFV感染經PI3K抑制劑LY294002預處理的Hela細胞

A.ORFV感染Hela細胞;B.ORFV感染經LY294002預處理的Hela細胞

2.3 PI3K/Akt通過激活其下游效應分子Bad抑制Hela細胞凋亡將ORFV接種于經PI3K特異性抑制劑LY294002(25 μmol/L)預處理1 h的Hela細胞，吸附1 h后加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養，Western blot檢測6、24 h后MDM2、GSK-3β、Bad的表達情況。結果顯示，與對照組相比，當PI3K被LY294002抑制后，ORFV感染Hela細胞MDM2和GSK-3β分子無顯著變化，但Bad表達量顯著增加(圖5A,B)。結果表明Bad分子參與了ORFV感染Hela細胞的抗凋亡過程。

A.PI3K/Akt下游效應分子MDM2、GSK-3β、Bad表達；B.ORFV感染Hela細胞Bad分子表達

3 討論

許多病毒感染宿主細胞后，能夠破壞宿主細胞的防御系統以確保自身的生存、復制和增殖，從而達到持續性感染的目的。細胞凋亡是一種細胞程序性死亡，以細胞收縮、核濃縮和漿膜起泡為特征，在組織發育、體內平衡和各類疾病中發揮著至關重要的作用，是宿主對病毒感染反應的關鍵組成部分。研究表明，大量病毒已經進化出復雜的分子策略來破壞宿主細胞的凋亡防御。在宿主細胞部署的各種防御機制中，一些依賴于細胞程序性死亡的途徑可被快速激活。例如，許多病毒獲得了Bcl-2的同源物來破壞宿主細胞的凋亡和自噬，以防止被感染細胞的過早死亡，從而影響宿主與病毒的相互作用，最終使病毒感染成功建立和傳播。

研究發現，痘病毒中1/3～1/2的病毒基因組致力于免疫逃避，其中多種痘病毒產物參與拮抗細胞凋亡反應，從而使病毒完成其生命周期并產生子代病毒粒子。如牛痘病毒(VACV)的B13和B22蛋白能夠抑制Caspase(半胱天冬酶)活性從而抑制凋亡；豬痘病毒(SPV)的032蛋白抑制PKR激活能夠減少或阻止Caspase-7和PARP-1的裂解。研究表明，ORFV作為痘病毒科副痘病毒屬的一員，其編碼的ORF125抗凋亡基因可抑制感染細胞的凋亡。實驗室前期研究發現，參與細胞增殖、分化和凋亡調控相關通路的重要分子PI3K對ORFV的復制增殖具有明顯的促進作用，然而具體的機制尚不清楚[22]。

本研究深入探究ORFV感染對PI3K/Akt通路和細胞凋亡的影響，以及PI3K/Akt通路介導ORFV感染Hela細胞凋亡抑制的途徑。研究發現，ORFV感染Hela細胞能夠激活p-Akt(Ser473)，而PI3K特異性抑制劑LY294002處理則使p-Akt表達顯著降低，說明ORFV感染Hela細胞能夠激活PI3K/Akt信號通路。此外，免疫熒光及流式細胞術檢測結果顯示，ORFV感染未引起Hela細胞凋亡，但PI3K/Akt信號被LY294002抑制后，細胞出現了明顯的凋亡現象，表明ORFV感染能夠通過激活PI3K/Akt信號通路抑制Hela細胞發生凋亡。進一步對PI3K/Akt下游效應分子MDM2、GSK-3β、Bad表達情況檢測發現，經PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002預處理后，ORFV感染Hela細胞MDM2、GSK-3β表達均無顯著變化，僅Bad分子表達顯著增加，表明Bad分子可能參與ORFV感染Hela細胞的抗凋亡過程。綜上所述，ORFV感染可通過激活PI3K/Akt/Bad信號抑制Hela細胞凋亡。該研究結果不僅有助于解析ORFV抑制感染細胞凋亡的機制，而且將為全面闡明ORFV免疫逃逸機制及疾病防控提供重要的理論依據。