杜仲葉提取物所含四種主要成分體外抗非酒精性脂肪肝活性研究＊

蔡丹紅，薛 梅，李 玉，朱思睿，劉笑利，張 良

（南京中醫藥大學藥學院/江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室 南京 210023）

1 介紹

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確損肝因素外所致的肝細胞內以脂肪過度累積（脂肪變性）為主要特征的臨床病理綜合征[1]。隨著生活水平的提高，該病在全球呈流行趨勢。截止2018年，全球NAFLD 患病率為25.24%，而我國NAFLD 的患病率為20.09%，其已成為威脅人類健康的一大因素[2]。NAFLD 的發病機制復雜，目前NAFLD經典的“二次打擊學說”被人們廣泛接受，“第一次打擊”是大量脂質在肝臟細胞內過度積累。這個累積過程與胰島素抵抗（Insulinresistance，IR）有關，胰島素濃度升高，導致外周脂肪組織發生分解，使得肝臟從血液中攝取的游離脂肪酸增多。同時游離脂肪酸氧化會隨著胰島素濃度升高而減弱，造成肝臟內大量游離脂肪酸轉化為三酰甘油，形成單純性非酒精性脂肪肝。“二次打擊”是指“一次打擊”之后，蓄積在肝臟的大量脂質發生氧化應激（Oxidation stress，OS）與脂質過氧化（Lipid peroxidation，LPO）引起肝細胞炎癥、肝纖維化、肝硬化、甚至肝細胞癌[3]。目前臨床上治療NAFLD，主要有降脂藥如非諾貝特類、洛伐他汀類；降糖藥如雙胍類、胰高血糖素樣肽（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動劑和二肽酰肽酶4（Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑；抗氧化劑如維生素E（Vitamin E，VE）、還原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、水飛薊素等；肝保護藥物如熊去氧膽酸（Ursodeoxycholic acid，UDCA）；FXR 激動劑如奧貝膽酸等。目前，尚無明確藥物治療NAFLD。因此，尋求防治NAFLD 藥物并探討其作用機制迫在眉睫。

杜仲為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliv）的干燥樹皮，是我國傳統藥材，在我國有兩千多年的藥用歷史。《神農百草經》將其列為上品，性溫，味甘，歸肝、腎經，具有補肝腎，強筋骨，安胎的功效，用于治療肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無力，頭暈目眩，妊娠漏血，胎動不安等，被廣泛用于中藥臨床復方和多種中成藥中如杜仲降壓片和強力天麻杜仲膠囊。由于杜仲傳統藥用部位為皮部，樹齡達到一定年限方可剝皮，且剝皮后極易造成杜仲樹死亡，對杜仲資源造成極大浪費，嚴重影響杜仲資源的可持續發展。為解決這種問題，人們相繼開展了對杜仲其它非傳統藥用部位化學成分和藥效研究，其中杜仲葉、雄花、種子等部位的研究較為顯著[4]。在2005年《中國藥典》將杜仲葉單獨收載為一種藥材，隨后的2版藥典一直沿用[5]。杜仲葉成分豐富，主要含有黃酮類、木脂素類、環烯醚萜類、多酚類、萜類和甾體類、苯丙素類、多糖類等成分[6]，具有抗氧化、降血壓、調節血脂、降血糖、抗骨質疏松、抗疲勞、預防肥胖、抑菌等藥理作用[7]。臨床上主要用于治療高血壓、高血脂、高血糖、安胎及骨質疏松等[8,9]。有相關報道顯示[10,11]，杜仲葉提取物能顯著降低高脂飲食誘導肥胖小鼠血漿中高血糖和高血脂水平，改善肝臟脂肪變性，對防治NAFLD 有明顯作用。然而，目前杜仲葉提取物防治NAFLD的活性成分及其作用機制尚不清楚。因此研究杜仲葉提取物防治NAFLD的主要活性成分及其作用機制意義重大。

2 材料和方法

2.1 材料儀器

HepG2 細胞系獲自中國科學院細胞庫（中國上海）儲存于-80℃冰箱，南美胎牛血清（Gibco），青鏈霉素雙抗（Solarbio），DMEM培養基（Gibco，Lot：8119288），胰蛋白酶（Gibco），TG試劑盒（批號：20190716）、TC試劑盒（批號：20190511）、HDL-C試劑盒（批號：20190713）、LDL-C 試劑盒（批號：20190712）、ALT 試劑盒（批號：2090715），AST試劑盒（批號：20190716）購于南京建成科技有限公司，棕櫚酸標準品（批號：SLBQ8869V），綠原酸標準品（批號：Y24J7K16726）、杜仲苷標準品（批號：K02N7B23963）、車葉草苷標準品（批號：ZN1110BB14）、京尼平苷酸標準品（批號：Y02A9H57757）購于上海源葉科技有限公司，UPLC（美國waters 公司），Discovery V20倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），Synergy HT型酶標儀（Bio-Tek，USA）。

2.2 杜仲葉提取、分離、純化、凍干

將杜仲葉粉碎，采用60%乙醇在80℃蒸餾提取，第1 次提取3 h，第2 次提取2 h，提取后，合并提取液，紗布過濾，濾液經NKA-2 樹脂柱洗脫純化，純化后濾液在60℃下減壓蒸餾濃縮，回收乙醇，得到杜仲葉提取物濃縮液，杜仲葉提取物濃縮液進行冷凍干燥制成杜仲葉提取物凍干粉，杜仲葉提取物凍干粉置干燥器中保存。

2.3 細胞培養

將HepG2 細胞在補充有10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養基中，于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養。當細胞匯合度達到80%時，采用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3進行傳代。

2.4 實驗分組及給藥

取對數生長期的細胞，調整細胞細胞密度為2 ×105Cells·mL-1，接種于6 孔板。設正常組、模型組、綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組。綠原酸組給藥40μmol·L-1、杜仲苷給藥40μmol·L-1、京尼平苷酸組給藥40μmol·L-1、車葉草苷組給藥40μmol·L-1。

2.5 NAFLD細胞模型的建立

根據前期試驗選擇最佳棕櫚酸干預濃度為300μmol·L-1模擬高脂環境，建立NAFLD 細胞模型，干預HepG2細胞24 h。

2.6 油紅O染色

將HepG2細胞制備細胞懸液，調整細胞密度為1×105Cells·mL-1，接種于24 孔板。設正常組、模型組、綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組，37℃、5% CO2培養箱培養12 h，待細胞完全貼壁后，用棕櫚酸處理HepG2細胞24 h，建立NAFLD細胞模型。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h 后，棄培養基，PBS 沖洗2 次，4%多聚甲醛1 mL 固定細胞30 min，棄4%多聚甲醛，PBS 清洗2 遍，加入500μL 油紅O 工作液（三蒸水∶油紅O = 2∶3）37℃避光30 min，50%異丙醇洗滌15 s，雙蒸水清洗3 次，至背景透明，倒置顯微鏡拍照，采用Image軟件分析圖像。

2.7 細胞中TG、TC、LDL-C、HDL-C的檢測

取對數生長期的細胞，調整細胞密度為2×105Cells·mL-1，接種于6 孔板，于37℃、5%CO2培養箱中過夜，待細胞生長至70%-80%。設正常組、模型組、綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組每組設置5個復孔，用棕櫚酸處理HepG2細胞24 h，建立NAFLD細胞模型。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h 后收集細胞，細胞超聲破碎儀超聲裂解，按照TG、TC、HDL-C、LDL-C試劑盒說明書進行檢測。

2.8 細胞上清液中AST、ALT檢測

取對數生長期的細胞，調整細胞密度為2×105Cells·mL-1，接種于6孔板，于37℃、5%CO2培養箱中過夜，待細胞生長至70%-80%。設正常組、模型組、綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組每組設置5個復孔，用棕櫚酸處理HepG2細胞24 h，建立NAFLD細胞模型。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h 后，收集細胞培養液，按照AST、ALT 試劑盒說明書進行檢測。

2.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進行相關統計分析，兩組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），所有數據以±s表示。P＜0.05 視為有顯著性差異。

3 結果

3.1 杜仲葉提取物主成分分析

精密稱取杜仲苷標準品7.1 mg，京尼平苷酸標準品8 mg，綠原酸標準品5.1 mg，車葉草苷標準品6.35 mg，溶于甲醇中，甲醇定容至5 mL，備用。精密稱取69.23 mg 杜仲葉提取物凍干粉溶于80%甲醇，定容至10 mL 備用，精密吸取杜仲葉提取物溶液200μL 并加入甲醇 800 μL，渦旋混勻3 分鐘，13000 rpm 離心15 min 備用。用UPLC-MS 檢測，流動相：A-乙腈，B-0.1%甲酸；色譜柱：Waters MassLynx 100×2.1 mm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40℃；檢測波長：198 nm（綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸），237 nm（車葉草苷）；進樣量：10 μL，混合對照品UPLC 圖譜和杜仲葉提取物UPLC 圖譜（圖1），杜仲葉提取物中杜仲苷含量16.72μg·mg-1、京尼平苷酸含量18.37 μg·mg-1、綠原酸含量6.3μg·mg-1、車葉草苷含量0.14μg·mg-1（表1）。

圖1 高效液相色譜圖

表1 杜仲葉提取物四種化學成分含量表

3.2 杜仲葉提取物四種主成分對HepG2 細胞內脂質的影響

綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷（40μmol·L-1）處理HepG2 細胞48 h，油紅O 染色檢測綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷對HepG2 細胞內中性脂肪含量的影響，于光學顯微鏡下觀察（圖2）。顯微鏡下觀察可見，肝細胞沉積的中性脂肪呈紅色，模型組可見細胞內中性脂肪沉積較多，分布較大。綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組與模型組比較，肝細胞內中性脂肪沉積不同程度減少、分布范圍縮小，其中京尼平苷酸效果較明顯。油紅O 染色結果說明，杜仲葉提取物中綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷可明顯減少HepG2 細胞中中性脂肪的形成，其中京尼平苷酸的效果較好。

3.3 杜仲葉提取物四種主成分對HepG2 細胞內TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的影響

圖2 HepG2細胞油紅O染色（200×）

圖3 杜仲葉提取物4種主成分對HepG2細胞內TG、TC、HDL-C、LDL-C的影響

使用TG、TC、LDL-C、HDL-C 試劑盒檢測綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h，HepG2 細胞內TG、TC、LDL-C、HDL-C 的含量（圖3）。模型組TG含量顯著高于正常對照組（P＜0.001）；模型組TC含量顯著高于正常對照組（P＜0.001）；模型組LDL-C 含量顯著高于空白組（P＜0.001）；模型組HDL-C 含量與正常對照組比較無顯著性變化。與模型組比較，綠原酸顯著減少TG含量（P＜0.01）、杜仲苷顯著減少TG含量（P＜0.01）、京尼平苷酸顯著減少TG含量（P＜0.001）、車葉草苷對細胞中TG 無顯著影響，其中京尼平苷酸效果最明顯；與模型組比較，綠原酸顯著減少TC 含量（P＜0.01）、杜仲苷顯著減少TC 含量（P＜0.05）、京尼平苷酸顯著減少TC含量（P＜0.001）、車葉草苷顯著減少TC含量（P＜0.05），其中京尼平苷酸效果最明顯；與模型組比較，綠原酸顯著減少LDL-C 含量（P＜0.01）、杜仲苷顯著減少LDL-C 含量（P＜0.01）、京尼平苷酸顯著減少LDL-C 含量（P＜0.001）、車葉草苷顯著減少LDL-C 含量（P＜0.01），其中京尼平苷酸效果最明顯；與模型組比較，綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷對細胞中HDL-C含量無顯著改變。總之，京尼平苷酸降低細胞內TG、TC、LDL-C 效果最好。在NAFLD發生和發展中，蓄積在肝臟中的脂質可發生氧化應激和脂質過氧化，引起肝細胞炎癥，肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌，加重了NAFLD 的發展。TG、TC、LDL-C進入血液中可進一步形成高脂血癥，可引發其它代謝綜合征。實驗結果說明，杜仲葉提取物中綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷可明顯減少HepG2 細胞內TG、TC、LDL-C 的含量，能提高肝臟細胞抗NAFLD活性，其中京尼平苷酸的效果較好。

圖4 杜仲葉提取物四種化合物對HepG2細胞培養基中AST、ALT的影響

3.4 杜仲葉提取物四種主要成分對HepG2 細胞培養液中AST、ALT的影響

使用AST、ALT 試劑盒檢測綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h，HepG2 細胞培養液中AST、ALT 的含量（圖4）。實驗結果顯示，模型組與正常組比較，細胞培養液中ALT 顯著升高（P＜0.01）、ALT 顯著上升（P＜0.001）。與模型組比較，綠原酸可顯著減少ALT 含量（P＜0.001）、杜仲苷可減少ALT 含量（P＜0.01）、京尼平苷酸可顯著減少ALT 含量（P＜0.001）、車葉草苷可顯著減少ALT 含量（P＜0.01），其中綠原酸和京尼平苷酸效果較好。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸可降低細胞培養液中AST 含量，其中京尼平苷酸效果最好，車葉草苷對細胞培養液中AST 無影響。與模型組比較，綠原酸可顯著減少AST 含量（P＜0.001）、杜仲苷可顯著減少AST 含量（P＜0.001）、京尼平苷酸可顯著減少AST 含量（P＜0.001），車葉草苷對AST 含量無顯著影響，其中京尼平苷酸效果最好。總之，京尼平苷酸降低細胞培養液中ALT、AST 效果最好。對于NAFLD 患者AST、ALT 能較好地判斷脂肪變性程度以及炎癥程度，可用于評估NAFLD 患者預后。實驗結果說明，杜仲葉提取物中綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷可明顯減少HepG2 細胞培養液中ALT、AST 含量，能改善NAFLD 模型肝臟脂肪變性和炎癥，其中京尼平苷酸效果最好。

4 討論

1980年Ludwig 等[12]將無飲酒史肥胖和糖尿病（DM）患者出現的非酒精性脂肪肝和肝小葉炎癥病變命名為非酒精性脂肪肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH），才步入NAFLD 研究時代。隨著生活方式轉變，其患病率逐漸上升，西方國家的患病率約為15%-30%，我國約15%，且發病率呈逐年上升和低齡化趨勢[13]。NAFLD 主要特征是三酰甘油在肝臟大量蓄積，在不存在肝細胞損傷情況下，被稱為單純性脂肪肝，一般認為是良性的。在存在肝小葉炎癥和肝細胞損傷情況下，被稱為非酒精性脂肪肝炎。NAFLD 患者易患肝臟相關并發癥，如肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和肝外疾病如心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）和糖尿病[14]。目前，尚沒有治療NAFLD 有效藥物，因此開發治療NAFLD的藥物并探討其作用機制非常有意義。

杜仲是我國特有的藥材，其藥用歷史悠久，在臨床上有著廣泛的應用。杜仲葉活性成分豐富、藥理作用突出、再生循環能力強、產量巨大，是很好的杜仲樹皮替代來源。關于杜仲葉對杜仲樹皮的替代性研究是目前的一個熱點。許多研究結果表明，杜仲葉和杜仲樹皮相比，活性成分基本相同，藥理作用相似。近年來有研究表明[15]，杜仲葉總黃酮能顯著降低高血脂大鼠血清中TC、TG、脂蛋白、載脂蛋白B（Apolipoprotein B，Apo-B）及LDL-C 含量，顯著升高HDL-C 及載脂蛋白A（Apolipoprotein A，Apo-A）的含量。有研究表明[16]，杜仲葉多糖能明顯降低高血脂模型小鼠血清TC、TG、LDL-C、脂蛋白a 和Apo-B 水平，明顯提高HDL-C 和Apo-A 水平。并且有體外研究表明[17]，杜仲葉提取物能通過增強溶酶體活性來降低棕櫚酸誘導HepG2 細胞內內質網應激和肝臟脂質積累。其機制可能是杜仲葉提取物降低肝臟脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMG-CoA）還原酶及肉堿棕櫚酰轉移酶（Carnitine Palmitoyltransferase 1A，CPT-1A）活性，通過抑制肝臟脂肪酸和膽固醇的生物合成，增加肝臟脂肪酸β氧化，減少肝臟脂質積累。有研究表明[18]，NAFLD 患者血清中ALT 升高最常見，常伴有AST 升高。該研究通過制備杜仲葉提取物，檢測杜仲葉提取物中主要成分，對杜仲葉提取物主要成分進行抗NAFLD研究。實驗結果顯示，杜仲葉所含主要成分為綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸和車葉草苷，其中京尼平苷酸的含量較高。油紅O 染色結果顯示，杜仲葉四種主要成分能不同程度降低細胞內脂質含量，京尼平苷酸的效果最好。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸和車葉草苷能不同程度降低細胞內TG、TC、LDL-C 的含量，其中京尼平苷酸效果最好；綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸能明顯降低細胞上清液ALT、AST含量，其中京尼平苷酸效果最好。研究結果表明，杜仲葉所含四種主要成分可不同程度改善細胞內脂質含量，其中京尼平苷酸效果最好，可作為杜仲葉中潛在的抗非酒精性脂肪肝活性成分，其作用機制需進一步研究，且該研究對促進我國杜仲資源可持續發展具有重要意義，值得進一步研究。