福建省兩棲類新記錄
——粵琴蛙

黃雅瓊，李文周，陳 斌，蔡孝星，鄭志學，呂植桐

(1.福建戴云山國家級自然保護區管理局，福建 德化 362500；2.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

蛙科(Ranidae)琴蛙屬(Nidirana)物種廣泛分布于東亞和東南亞的亞熱帶地區，目前該屬共有已知物種14種，且所有已知種在我國均有分布[1]。彈琴蛙(N.adenopleura)是琴蛙屬中命名較早的物種之一，曾經是該屬中分布范圍最廣的物種，被廣泛記錄于我國華東、華南、西南等地[2]。近年來，隨著分子生物學技術的發展及綜合分類法的應用，原先曾被鑒定為彈琴蛙的多個不同種群，先后被發表為新物種[1，3-4]。其中，分布于廣西大瑤山的種群被認定為瑤琴蛙(N.yaoica)，分布于貴州雷公山和梵凈山的種群被認定為雷山琴蛙(N.leishanensis)，分布于湖南湘江流域的種群被認定為湘琴蛙(N.xiangica)，分布于浙江北部的種群被認定為孟聞琴蛙(N.mangveni)，分布于廣東北部、湖南東南部和江西西南部的種群為粵琴蛙(N.guangdongensis)。

分布于福建省的琴蛙種群，此前也均被鑒定為彈琴蛙[2，5-6]。此后，經過形態比較和分子系統發育分析研究，福建北部的種群被確認為是真正的彈琴蛙[1，7]，而福建南部的琴蛙種群目前仍缺乏相關厘定。2017年6月，在福建戴云山國家級自然保護區采集到4號琴蛙屬標本，經過詳細的形態比較和分子系統發育分析鑒定為粵琴蛙，為福建省兩棲類新記錄。本發現為琴蛙屬的系統學和譜系地理學研究提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

4號琴蛙標本是2017年6月26日夜晚徒手采集自福建戴云山國家級自然保護區九仙山(118°06′44.20″E、25°41′39.96″N)。標本安樂死后，剪取大腿腹側肌肉樣品保存于95%乙醇中；標本用5%福爾馬林溶液固定定型后轉移至70%乙醇溶液中，保存于中山大學生物博物館(SYS)。

1.2 形態鑒定與測量

使用游標卡尺對4號標本的形態特征進行測量，精確到0.1 mm。測量標準及形態特征鑒定均依照 Lyu 等[1]的定義。

1.3 DNA提取、PCR擴增和測序

使用Tiangen Genomic DNA Kit試劑盒提取樣品的基因組DNA(方法參照其說明書)，提取的DNA溶液保存于-20 ℃備用。利用PCR擴增線粒體COⅠ基因片段。擴增引物參照Lyu等[1]的 dgLCO (5′-GGTCAACAAATCATAAAGAYATYGG-3′) 和dgHCO(5′-AAACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA-3′)，反應條件為95 ℃預變性4 min，隨后以94 ℃變性40 s、52 ℃退火40 s、72 ℃復性1 min進行35個循環，最后72 ℃補充延伸10 min。PCR 產物進行雙向測序，所得序列用于系統發育分析。

1.4 序列分析及分子系統樹的構建

從GenBank數據庫下載琴蛙屬部分物種及其近緣類群拇棘蛙屬(BabinaThompson)，1912物種的相關COⅠ基因序列(表1)。拇棘蛙屬物種作為構建分子系統樹的外群[7]。所有序列在MEGA 6.0軟件[8]中使用Clustal W算法[9]進行序列比對，采用默認參數。比對后的序列在jModelTest v2軟件中基于AIC標準計算最佳核苷酸替代模型；用MEGA 6.0 軟件的p-distance距離模型計算各物種間的遺傳距離；使用RaxmlGUI 1.3軟件[10]，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)構建ML系統發育樹，并進行1000次bootstrap重復抽樣分析以檢驗系統發育樹各節點置信度。

表1 所有樣品的采集信息、標本憑證和GenBank序列號

續表1

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定及比較

采集自福建戴云山國家級自然保護區的4號琴蛙標本為3雄1雌(圖1)，所有標本的形態量度結果見表2，其形態符合粵琴蛙的鑒定特征。

A1.雄性背面；A2.雄性腹面；B1.雌性背面；B2.雌性腹面

體型大，雄性頭體長53.1～53.6 mm，雌性頭體長56.6 mm。頭長大于頭寬；吻端鈍圓，突出于下唇，吻長大于眼徑；吻棱明顯，頰部向內略微凹陷；鼻孔位于吻、眼之間，略近于吻端；眼間具顯著松果體；眼間距小于鼻間距；鼓膜清晰，小于眼徑，接近眼；不具顳褶；具犁骨棱和犁骨齒；舌末端具缺刻。雄性具一對咽下外聲囊。

前肢較粗壯；指細長，指序為Ⅱ<Ⅰ<Ⅳ<Ⅲ；指末端略膨大成吸盤，除I指外均具腹側溝；無蹼，Ⅰ指外側及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ指內外側具顯著緣膜；關節下瘤顯著，各指基部具不明顯的指基下瘤；掌突3個，橢圓形、大而顯著。雄性第I指基部背面具單個婚墊，無婚刺。

后肢相對粗壯，后肢前伸貼體時脛跗關節達鼻孔，跟部重疊；趾細長，趾序為Ⅰ<Ⅱ<Ⅴ<Ⅲ<Ⅳ；趾末端略膨大成長而尖的吸盤，各趾均具顯著腹側溝；腳蹼中等大小，蹼式：Ⅰ1～2Ⅱ1～2Ⅲ1～3Ⅳ 3Ⅴ～1V；各趾內外側均具顯著緣膜；關節下瘤顯著；內蹠突橢圓形，長約為寬的3倍；外蹠突不顯著，小而圓。

表2 福建戴云山國家級自然保護區度量粵琴蛙標本的形態度量

背部皮膚粗糙；后背部及后肢密被錐狀角質刺，頭部及體背具稀疏的角質刺；背側褶發達，自上眼瞼后緣延伸至腹股溝上方，末端斷斷續續，具稀疏角質刺；雄性體側粗糙，具小疣及稀疏角質刺，具顯著、光滑、略微凸起的肩上腺；雌性體側較光滑，不具角質刺，不具肩上腺。腹面光滑，腿后部及肛周圍具扁平疣。

生活時背面棕紅色，角質刺白色；松果體黃色；背部具斷續的黃色背中線，自松果體延伸至肛部上方；體側上部灰褐色，下部淺黃色，肩上腺米黃色。前肢淺褐色，具黑色條紋；后肢深褐色，具黑色橫紋。頰部及顳部棕色，鼓膜淺褐色；虹膜上1/3淺褐色、下2/3紅棕色。腹面白色；雄性咽部粉色。

2.2 分子系統發育關系

PCR擴增獲得福建戴云山國家級自然保護區琴蛙線粒體COⅠ基因序列4條，長度各569 bp。用于系統發育分析的最佳核苷酸替代模型為GTR+G+I。最大似然系統發育樹(圖2)顯示，采自福建戴云山自然保護區的琴蛙標本與廣東北部、湖南東南部、江西西南部的粵琴蛙樣品聚為支持率較高(99%)的單系群，而與福建北部、江西中部、浙江南部、臺灣的彈琴蛙樣品親緣關系甚遠。基于p-distance距離模型估算的遺傳距離(表3)顯示，福建戴云山國家級保護區的琴蛙種群內部遺傳距離為0.1%；與廣東北部、湖南東南部、江西西南部的粵琴蛙種群遺傳距離為1.8%，略大于該種群內部的遺傳距離(1.3%)；與彈琴蛙的遺傳距離為9.4%。分子系統發育分析結果支持福建戴云山國家級自然保護區的琴蛙標本為粵琴蛙，而非原文獻記錄的彈琴蛙[2，5-6]。

表3 基于線粒體CO Ⅰ基因的琴蛙屬物種間p-distance遺傳距離

表3(續)

分支末端數字為樣品序號，節點上的數字為最大似然法自舉值

3 討論

粵琴蛙為2020年新發表的兩棲動物新物種，在此之前已知的分布范圍為廣東北部、湖南東南部、江西南部的南嶺山脈中段及羅霄山脈南部[1]。本次在福建中部的戴云山國家級自然保護區報道該物種的新分布，是福建省兩棲類新記錄。這一發現，將粵琴蛙的分布區域向東擴展至福建中部(圖3)。此前，福建北部、江西中部的琴蛙種群已被確認為彈琴蛙[1，7]。因此，可以推測從廣東北部沿南嶺山脈、蓮花山脈往東的閩南、粵東、贛南等地此前記錄的彈琴蛙種群也應該是粵琴蛙。在這些地區需要進行全面和詳細的調查，以了解這一新物種確切的分布范圍及種群狀況。

戴云山國家級自然保護區位于福建中部的戴云山脈，其北部為福建最大河流閩江。目前已經報道確認過的福建北部的彈琴蛙種群[1，7]，均分布于閩江以北；而此次報道的粵琴蛙種群分布于閩江以南的戴云山。這也表明，閩江可能是彈琴蛙和粵琴蛙2個物種在福建省內分布區的分界線。

星形為福建戴云山國家級自然保護區；紅色圓形為此前報道的粵琴蛙分布點；黑色圓形為此前報道的彈琴蛙分布點；右上方小圖為福建戴云山國家級自然保護區粵琴蛙生境。

*：感謝福建戴云山國家級自然保護區管理局賴鐘俊、陳文偉、徐榮地、陳亞婷，中山大學王英永、王健協助完成室內實驗、野外調查工作，并對本論文提供了寶貴建議和幫助。