油茶根際土壤解鉀菌的發(fā)酵培養(yǎng)

吳 松，王美鑫，張曉陽，張媛媛，韓森匯，宋 漳

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)為山茶科山茶屬植物，是我國重要的經(jīng)濟林樹種[1]，與油橄欖、油棕、椰子并稱世界“四大木本油料植物”[2-3]。由油茶籽加工的茶油富含不飽和脂肪酸，其營養(yǎng)價值可與橄欖油相媲美，是優(yōu)質(zhì)健康的植物食用油，被譽為“東方橄欖油”，長期食用可增強人體免疫力、降低膽固醇、預(yù)防肥胖和心血管等疾病[4]。

鉀作為植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素[5]，參與多種酶的活化，促進植物生長發(fā)育，參與細胞滲透作用和物質(zhì)運輸，增強植物抗病等抗逆性[6-7]。然而，土壤中95%的鉀元素都以礦物質(zhì)的形式存在于鉀長石和云母中，不能被植物直接吸收利用[8]。解鉀菌(Potassiumbacteria)又稱硅酸鹽細菌，是從土壤中分離出來的，能將難溶性鉀等礦物質(zhì)元素轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄晕镔|(zhì)供植物吸收利用的微生物[9]。除了能溶解礦質(zhì)元素外，解鉀菌還能產(chǎn)生促進植物生長的激素，有利于植物生長和提高品質(zhì)[10]。韓曉陽等[11]從茶園土壤中分離、篩選出最強菌株K2，進行條件優(yōu)化施用后發(fā)現(xiàn)茶葉各項指標都有提升；伍善東等[12]從油菜田土壤中分離解鉀能力最強的菌株JK-3發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵液的濃度有明顯提高。本試驗以從油茶根際土壤采集分離的解鉀優(yōu)良活性菌株為對象，篩選優(yōu)化培養(yǎng)條件，以期為高效微生物肥料研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

解鉀細菌為已分離的15株油茶根際解鉀菌，菌株編號為CoPDB 1—CoPDB 15，保存在福建農(nóng)林大學(xué)森林保護研究所。

1.2 供試培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蔗糖5.0 g，磷酸氫二鉀0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，淀粉5 g，硫酸鈣0.1 g，硫酸銨1.0 g，氯化鈉0.2 g，碳酸鈣0.5 g，水1000 mL；培養(yǎng)基A：蔗糖5.0 g，磷酸氫二鈉0.5 g，云母粉1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化鐵0.005 g，水1000 mL；培養(yǎng)基B：蔗糖5.0 g，磷酸氫二鈉0.2 g，云母粉1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化鐵0.005 g，硫酸銨1.0 g，碳酸鈣0.1 g，水1000 mL；培養(yǎng)基C：蔗糖1.0 g，磷酸氫二鈉2.0 g，云母粉1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化鐵0.005 g，硫酸銨1.0 g，碳酸鈣0.1 g，淀粉5.0 g，水1000 mL。

1.3 解鉀細菌篩選

用雙層平板法[13]篩選解鉀細菌，下層倒云母瓊脂培養(yǎng)基，上層倒硅酸鹽培養(yǎng)基，將15株菌株接種在雙層平板上。30 ℃培養(yǎng)4 d，選取菌落直徑大、表面粘稠性好、解鉀圈大的菌株進行發(fā)酵優(yōu)化。

1.4 篩選菌株的活化

將CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的菌液接種于種子液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r·min-1條件搖培3 d，獲得一級種子菌液。取一級種子菌液5 mL分別接種于種子液體培養(yǎng)基，同等條件繼續(xù)搖培3 d，獲得二級種子菌液，同樣操作獲得三級種子菌液，活化供試菌株。

1.5 篩選菌株的生物量及鉀含量測定

用紫外分光光度法測定生物量[14]。將菌株種子液置于30 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)10 d，每天定量吸取種子液3 mL于比色皿中，以純凈的培養(yǎng)基為對照，每個樣品重復(fù)3次；對照比色皿放在第一個，其余樣品依次排列，采用分光光度計波長600 nm檢測，對照組進行校對，其余樣品依次檢測，記錄每天樣品測定值。鉀含量測定采用火焰光度計法[15]：吸取發(fā)酵液10 mL，4000 r·min-1離心后吸取少許上清液，用火焰光度計測定其鉀的含量。

1.6 發(fā)酵條件優(yōu)化方法

1.6.1 培養(yǎng)基篩選 吸取CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的菌液各5 mL分別接種于培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B、培養(yǎng)基C，在30 ℃、200 r·min-1條件下?lián)u培7 d，以不接種液體培養(yǎng)基為對照，各3次重復(fù)。取少量菌液用比濁法測定OD值，火焰光度計測定鉀含量，選出最優(yōu)培養(yǎng)基。

1.6.2 pH 分別在250 mL的錐形瓶中裝入最優(yōu)液體培養(yǎng)基50 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2，高壓滅菌；分別吸取CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的菌液各5 mL接種至不同pH的液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r·min-1條件下?lián)u培7 d，以pH 7.0不接種培養(yǎng)基為對照，每處理3次重復(fù)。取少量菌液用比濁法測定OD值，火焰光度計測定鉀含量，篩選最佳pH值。

1.6.3 裝液量 在250 mL的錐形瓶中分別裝入50、75、100、125、150、175 mL的液體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌消毒后，分別吸取CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的菌液各5 mL接入含有不同量液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30 ℃、200 r·min-1條件下?lián)u培7 d，以不接種的液體培養(yǎng)基為對照，各3次重復(fù)。取少量菌液用比濁法測定OD值，火焰光度計測定鉀含量，篩選最佳裝液量。

1.6.4 接種量 分別吸取CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的種子液各1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL接入液體培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r·min-1條件下?lián)u培7 d，以不接種的液體培養(yǎng)基為對照，各3次重復(fù)。取少量菌液用比濁法測定OD值，火焰光度計測定鉀含量，篩選最佳接種量。

1.6.5 溫度 分別吸取最適接種量的CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的種子液接入液體培養(yǎng)基，分別在24、26、28、30、32、34 ℃等不同溫度，200 r·min-1條件下?lián)u培7 d，以不接種的液體培養(yǎng)基為對照，每處理3次重復(fù)。取少量菌液用比濁法測定OD值，火焰光度計測定鉀含量，篩選最佳溫度。

1.6.6 搖床轉(zhuǎn)速 分別吸取最適接種量的CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的種子液接入液體培養(yǎng)基，分別在30℃，120、140、160、180、200、220 r·min-1轉(zhuǎn)速條件下?lián)u培7 d，以不接種的液體培養(yǎng)基為對照，每處理3次重復(fù)。取少量菌液用比濁法測定OD值，火焰光度計測定鉀含量，篩選最佳搖床轉(zhuǎn)速。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

雙層培養(yǎng)法觀測結(jié)果(圖1)表明，各供試解鉀細菌菌株的解鉀能力各異，其中CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15解鉀細菌的R/r值>1(R為透明圈直徑，r為菌落半徑)，解鉀能力較強，故選取這3株效果較好的解鉀細菌菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化試驗。

圖1 解鉀細菌的篩選

2.2 生長曲線

從圖2、圖3可看出，3種解鉀菌的生物量和解鉀能力均隨時間的增加先緩慢增長、再急劇增長、最后下降，解鉀細菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15均在7 d時解鉀能力和生物量達到最高值。可見，搖培7 d為解鉀菌株最適培養(yǎng)時間。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)基 在供試的3種培養(yǎng)基中，解鉀細菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15都可正常生長，其中在培養(yǎng)基A中的生物量最佳。3種解鉀菌在培養(yǎng)基A中的生長與培養(yǎng)基B、C差異顯著(圖4)。解鉀細菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15在培養(yǎng)基A中的解鉀能力最強。其中，解鉀菌CoPDB 6、CoPDB 13的解鉀能力在培養(yǎng)基A中顯著高于培養(yǎng)基B和培養(yǎng)基C，而解鉀菌CoPDB 15在3種培養(yǎng)基中不存在顯著差異(圖5)。

2.3.2 不同pH對解鉀細菌的影響 從圖6可以看出，解鉀菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15在不同pH下都能生長，pH為7.4時生長最好，生物量達到最大值。圖7表明，隨著pH值升高供試菌株解鉀能力隨之增強，達到最大值后下降明顯，最后趨于平穩(wěn)，CoPDB 6菌在pH為7.4時解鉀能力最好，CoPDB 13菌和CoPDB 15菌在pH為7.2時解鉀能力最強。

2.3.3 不同裝液量對解鉀細菌的影響 從圖8可以看出，在接種量固定的情況下，供試菌株生長量總體上隨著裝液量的增加而減少，呈遞減趨勢，以20%(即50 mL/250mL鉀細菌生物量)裝液量發(fā)酵培養(yǎng)菌株產(chǎn)量最高，為最適裝液量。數(shù)據(jù)分析結(jié)果可得出，3株解鉀菌在裝液量為20%時解鉀細菌生物量顯著高于其它裝液量。解鉀能力測定結(jié)果(圖9)表明，3株解鉀菌株隨著裝液量的增加解鉀能力呈下降趨勢，CoPDB 6、CoPDB 13菌株在裝液量20%(即50 mL/250 mL)時解鉀能力最好，CoPDB 15菌在裝液量30%(即75 mL/250 mL)時解鉀能力最好。總體來說，裝液量在20%～30%時，解鉀細菌的生長和解鉀能力最優(yōu)。

2.3.4 不同接種量對解鉀細菌的影響 從圖10、圖11可以看出，解鉀菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15在接種量增加的情況下，生物量和解鉀能力總體呈現(xiàn)先增長趨勢，在達到最大值后開始下降，以接種量為9%(即4.5 mL/50 mL)的情況下生長量和解鉀能力最佳。在接種量為9%(即4.5 mL/50 mL)時，3株菌株的生長量和解鉀能力顯著高于其它接種量。

2.3.5 不同溫度對解鉀細菌的影響 由圖12、圖13可知，解鉀菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15在30 ℃時生長最優(yōu)并且解鉀能力也最好。3株解鉀菌均在30 ℃時，菌株的生長和解鉀能力與其它溫度間存在顯著性差異；在解鉀能力方面，3株菌株除30 ℃外，其它溫度間差異不顯著。因此，解鉀菌的最適生長發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.3.6 不同搖床轉(zhuǎn)速對解鉀細菌的影響 由圖14、圖15可知，解鉀菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15菌株在不同轉(zhuǎn)速下均能生長，菌株OD值最高和鉀含量最高時的轉(zhuǎn)速為200 r·min-1。即搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1是解鉀菌生長發(fā)酵最適條件。

3 小結(jié)與討論

油茶作為經(jīng)濟樹種具有很高的經(jīng)濟、健康、營養(yǎng)價值[16]。鉀素是植物生長的必要元素，能促進植物的生長代謝。土壤中雖含有大量的鉀元素，但大多數(shù)都是以硅酸鹽礦物的形式存在，不能被植物吸收[17]。解鉀菌具有高效的解鉀能力，茍志輝[18]從油茶根際中分離出73株解鉀菌，經(jīng)篩選K50菌株的解鉀最強，解鉀率達121.71 mg·kg-1；姜霽航等[19]從蘋果根際分離118株具有解鉀活性的菌株，菌株K105的解鉀最高有效態(tài)鉀增長23.09%。盛下放等[20]分離篩選的解鉀硅酸鹽細菌NBT菌株，其釋鉀量較對照增加226.0%。此外，解鉀菌還具有促進生長的功效，曹媛媛等[21]從煙草根際篩選獲得4株能促進煙草生長的解鉀菌，其中TK89促進效果最佳，不論在煙草哪個部位接種都能起到促進生長的效果；崔松松等[22]對油菜根際解鉀菌的研究中發(fā)現(xiàn)，解鉀菌能促進油菜生長，增加產(chǎn)量。解鉀菌對植物的生長發(fā)育有著重要的作用，本研究采用雙層平板法對保存于實驗室的15株解鉀菌的解鉀能力進行測定，篩選出3株解鉀能力較強的菌株，即CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15。

解鉀菌的培養(yǎng)條件對解鉀能力有較大影響，通過影響其生長和代謝使解鉀能力產(chǎn)生差異。本研究中，3株(CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15)解鉀菌的培養(yǎng)時間均在7 d時解鉀能力最佳，此后培養(yǎng)時間越長解鉀能力下降較快；在培養(yǎng)基A中，pH為7.2～7.4，溫度為30℃、搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時解鉀菌的解鉀能力最強，說明解鉀菌的適生環(huán)境為偏堿性，該結(jié)果與呂睿等[23]從獼猴桃土壤中分離出的解鉀菌的生存環(huán)境一致；3株解鉀菌在裝液量為20%～30%(50～75 mL/250 mL)時解鉀能力最好，當(dāng)裝液量逐漸增加時解鉀力下降，由此可見解鉀菌是屬于好氧型生物，在氧氣充足的條件下自身的代謝能力更好；接種量的選擇不僅要考慮解鉀能力的強弱，還需考慮生產(chǎn)實踐中的經(jīng)濟效益，3株解鉀菌在接種量為9%時解鉀效果最好。本研究對油茶根際解鉀菌的發(fā)酵研究結(jié)果表明，解鉀菌的接種量為9%、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r·min-1時解鉀效果最佳。與茍志輝[18]對油茶解鉀菌條件優(yōu)化的結(jié)果稍微有點差異，茍志輝的研究結(jié)果是最佳發(fā)酵接種量4%、溫度35 ℃、裝液量50 mL、轉(zhuǎn)速160 r·min-1。可能由于所采樣的地域不同，地域環(huán)境條件對解鉀菌的生存產(chǎn)生影響。