RHBDD1與乳腺癌的研究進展

宗 雪，居紅格，2

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014060；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院)

乳腺癌是全球女性高發病，嚴重威脅女性健康。目前，在分子水平上的研究是國內外專家的研究熱點，EP、PR、EGFR在乳腺癌的治療中已經成為治療靶標。RHBDD1(Rhomboid domain containing 1)又稱膜內絲氨酸蛋白酶，有研究表明其高表達促進胃癌、結腸癌的進展，研究已證實其在乳腺癌中也呈高表達水平，與乳腺癌的發生、發展密切相關。本文主要探討Rhomboid蛋白家族的起源、結構、功能和RHBDD1的起源、結構、功能以及與乳腺癌的關系進行論述，旨在為臨床提供新的治療方法。

1 Rhomboid蛋白的發現、家族結構及功能特點

1.1Rhomboid蛋白的發現 1995年，Christiane和Eric兩位諾貝爾獎獲得者通過掃描基因突變的果蠅幼蟲發現Rhomboid蛋白，此種果蠅幼蟲頭呈菱形狀，Rhomboid蛋白在果蠅生命活動中發揮重要作用[1]。近年來，Rhomboid蛋白還被發現于酵母菌、細菌、哺乳動物中，與人類疾病密切相關。Rhomboid蛋白家族怎樣進行蛋白水解尚不清楚，但其結構和功能隨著人類科技的進步逐漸清晰，這類家族蛋白與人類疾病發生發展密切相關。

1.2Rhomboid蛋白家族結構及功能特點 Rhomboid家族蛋白是一組極其穩定的，含有6～7個跨膜結構域，其本質為膜內絲氨酸蛋白酶的蛋白家族。該家族相關基因開放閱讀框架含有774個核苷酸序列，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，(A+T)%=50 %,共表達257個氨基酸。包含強堿性氨基酸(K，P)20個、強酸性氨基酸(D，E)16個、疏水性氨基酸(A，I，L，F，W，V)117個、極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)54個。它們的活性位點隱藏在細胞膜平面內，并在跨膜區內部或者鄰近跨膜區域內對底物進行加工切割，釋放到細胞外或管腔外，具有催化三聯體結構[2]。

大腸桿菌GlpG屬于此家族，研究人員通過X射線晶體學以2.1 A度的分辨率生成大腸桿菌GlpG的核心區域，結果表明GlpG由6個跨膜螺旋組成(圖1)。該結構有兩個特征。第一是分子內存在1個V形凹穴，深度約為10 A，內腔氨基末端的中心螺旋S4結構位于膜表面下方，在蛋白質內部形成一個水溶性空穴，從而打開細胞外側，S4頂端是催化基團；第二是膜嵌入循環，如圖中L1結構，此結構具有上部和內部表面都是親水性，而下表面是疏水的兩親特征。相對于蛋白質結構，其余部分的位置表明L1通常插入脂質雙層的外葉中。L1的疏水羧基末端區域是從大V形間隙內延伸到脂質層面[3]。

圖1 大腸桿菌GlpG

周華等[4]應用分子動力學模擬研究確定菱形蛋白酶基質進入活性位點的途徑在Loop3和Loop5之間(圖2)。Loop和Tm5的開放以及His150的轉移可能通過此途徑(襯底具有構象改變，以避免阻止His150)。此外，重要殘基His150、Trp157、Trp196、Gly198、Ser248、Met247、Trp236與底物形成相互作用，以便在此通路的出口處穩定底物。

圖2 大腸桿菌分子動力模型(引用自參考文獻4)

綜上所述，由L1上兩個氨基酸殘基W136、R137組成底物進入活性位點的門控位點，當底物接近跨膜蛋白活化中心，門控開啟，活化位點上部呈親水性，促進底物上半部螺旋區結構改變，進一步發生S201-H254Q親核催化反應，肽鍵水解斷裂。

1.3Rhomboid蛋白家族的分類 Rhomboid蛋白家族分為活性蛋白酶、iRhoms(無活性成簇)、其他rhomboid蛋白(無活性不成簇)，見圖3。活性蛋白酶最常見，其可分為分泌酶型、PARL型(位于線粒體，通常由6個TMH核心，N端附加一個TM組成)，活性蛋白酶分泌酶型又含分泌酶A型(由6個TMH核心和1個TM組成C端)、分泌酶B型(僅由6個TMH核心組成)。

圖3 Rhomboid蛋白家族分類

2 RHBDD1的發現、結構、功能特點

2.1RHBDD1的發現 RHBDD1(Rhomboid domain containing 1)屬于Rhomboid蛋白家族成員，2008年被Wang等[5]發現的Rhomboid家族的一個新成員。其在人類睪丸組織中表達水平較高，但在肺、前列腺、卵巢、子宮和宮頸等組織中表達水平很低。

2.2RHBDD1的結構、功能特點 RHBDD1作為膜內絲氨酸蛋白酶，主要由N末端菱形結構域和C末端結構域組成，共表達315個氨基酸，含有6個跨膜結構,活性位點位于跨膜區域，具有蛋白切割底物功能。首先，RHBDD1蛋白對其底物加工修飾并釋放，定位于內質網的底物在星形蛋白的作用下,轉移到高爾基體，與高爾基體上的RHBDD1蛋白相互作用，并分離釋放出具有活性的底物，然后底物被分泌到細胞外激活EGF受體，這是一個活性Spitz形式的提呈過程[1]。藺亞妮等[6]通過實時定量PCR方法，檢測發現RHBDD1基因在慢性髓系白血病(CML)患者骨髓細胞中的表達量明顯高于正常人，且BCR/ABL p210表達陽性的患者RHBDD1表達量低于BCR/ABL p210表達陰性的患者，證實RHBDD1高水平表達與CML發生具有相關性，尤其在BCR/ABL p210表達陰性患者的發病中發揮作用。RHBDD1能切割轉化生長因子α(TGFα)前體并釋放具有活性的配體，從而使表皮生長因子受體(EGFR)信號通路增強，刺激腫瘤細胞生長，最終可造成癌癥的發生和進展。史濟華等[7]發現，RHBDD1在胃癌的癌前病變、早期胃癌以及進展期胃癌組織中表達量均高于慢性胃炎組織，提示RHBDD1基因參與胃黏膜的惡性轉化過程。抑癌基因激活途徑-6(Tumor suppressor-activated pathway，TSAP6)又稱Steap3。RHBDD1主要位于TSAP6的第3跨膜結構域的C末端，進行切割并以活性依賴性方式誘其蛋白水解，且RHBDD1通過抑制TSAP6參加非經典外泌體分泌途徑的調節，在細胞內介導可調節的細胞內水解過程(RIP)，水解跨膜蛋白的C端跨膜結構域，產生的細小片段可在細胞生理過程中發揮至關重要的調節作用[8]。Song等[9]進行結腸直腸癌(CRC)鼠模型中證明RHBDD1表達與EGFR/Raf/MEK/ERK信號傳導路徑呈正相關，能夠促進腫瘤生長，并且RHBDD1可作為結腸、直腸癌(CRC)疾病預后的預測生物標志物。RHBDD1對膠質母細胞瘤細胞U251和U87MG的進展具有促進作用，并且其沉默導致細胞周期進展和細胞增殖的抑制[10]。

RHBDD1與其他疾病的聯系尚未被證實，有待進一步研究。與RHBDD1同屬扁菱形蛋白家族的RHBDD3被證實具有雙重作用，其一可以通過泛素化途徑參加DNAX激活蛋白12(DNAX activation protein of 12kDa，DAP12)的降解，從而增加DAP12的促癌作用。其二可以維持免疫穩態，為肝病的治療提供一個全新契機[11]。有報道，同屬扁菱形家族的另一蛋白RHBDD2的mRNA水平以及蛋白表達水平在乳腺癌中均高于正常乳腺組織，且主要表現為Ⅲ期乳腺癌。RHBDD2基因在乳腺惡性腫瘤中有擴增，下調其表達水平可抑制乳腺癌細胞增殖，其表達水平越高，患者總體生存期、無復發生存期、無轉移生存期越短[12-13]。

3 乳腺癌的研究進展

3.1診斷進展 根據國家癌癥中心最新統計結果表明，我國新發乳腺癌病例數達到27.24萬，每年死亡人數超過7萬。乳腺癌是發生于女性乳腺上皮組織和細胞的一種惡性腫瘤。乳腺癌患者99 %是女性，所以乳腺癌已成為女性最典型最易發生的惡性腫瘤性疾病之一。不僅在我國，甚至整個世界，乳腺癌也是女性惡性腫瘤發病率最高的疾病。隨著我國醫療水平和科學技術的不斷發展，診斷乳腺癌的方案和技術支持日益完善，治療方法和策略也隨之增強。通過分組乳腺癌患者的術后病理結果(彩超組、X線鉬靶組和X線鉬靶-彩超聯合組)，顯示與單一檢查相比，X線鉬靶聯合彩超對乳腺癌診斷具有更高的特異性、敏感性和準確性，是現階段診斷初期乳腺癌的首要方法，值得在臨床廣泛推廣和應用。MRI可作為超聲和鉬靶發現疑似病例時必要的補充檢查方式，且對浸潤性乳腺癌具有較高敏感性，鉬靶X線在乳腺癌癌前病變-乳腺非典型增生的診斷中具有重要的意義,是診斷乳腺非典型增生的較好方法[14]。免疫組化對乳腺癌的診斷研究表明，乳腺癌早期單個腫瘤標志物的檢出率較低。血清糖類抗原(Carbohydrate antigen,CA)153、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)及CA125的聯合檢測有利于提高乳腺癌早期檢出率和各個時期診斷的準確性,同時提高乳腺癌與乳腺其他良性疾病的鑒別與診斷。腫瘤標記物聯合檢測最為準確的標記物組合應當最低為3項，其診斷為乳腺癌的意義大，其中乳腺癌淋巴結轉移為陽性者，CA125標記物的診斷率更高[15]。

3.2治療進展 乳腺癌是由于乳腺導管上皮出現惡性改變而產生，臨床表現主要為乳房腫塊、乳頭溢液、腋窩淋巴結腫大等局部癥狀。乳腺癌晚期，癌細胞遠處轉移至身體多處組織和器官，患者生命受到嚴重威脅[16]。近年來，國家全面推廣乳腺癌的二級預防以及醫院普及多種早期診斷技術，乳腺癌早期診斷率因此不斷提高，但隨之出現的乳腺癌發病人口的不斷年輕化，要求廣大醫生不僅要進行根治性手術治療，更要注重年輕患者未來的生活質量，促進患者重視乳腺癌早期治療方案和方法,逐步實現乳腺癌初期診斷規范化、個體化的綜合診療[17]。乳腺癌的治療有內分泌治療、放療、化療、分子靶向治療、外科治療、姑息治療、推拿、音樂放松療法、冥想瑜伽等。乳腺癌的首選治療方案一直是手術治療，醫生根據檢查結果判斷腫塊大小，浸潤深度和淋巴結轉移情況決定手術方案。傳統乳腺癌根治術對病人身體表面創傷較大，并且生存率低于改良乳腺癌根治術，因此現在很少使用這種術式。目前治療乳腺癌的首選手術方式為改良后的乳腺癌根治術。手術方式逐漸向縮小切除范圍發展。改良根治術治療包括保乳手術(Breast Conservation therapy,BCT)和術后輔助放療。保乳手術BCT包括瘤組織的局部廣泛清除及腋窩淋巴結的清掃(Axillary lymph node dissection，ALND)或前哨淋巴結活檢(Sentinel l ymph node biopsy，SLNB)。保乳手術判斷標準以保證患者生存率為前提，選擇合適術式，直接關系到術后效果和乳房外觀[18]?；颊呤欠襁M行保乳手術沒有絕對標準，我國大部分醫院的標準為腫瘤單發、周圍型、直徑2～3 cm；腫瘤位置在乳房邊緣且離乳暈>2 cm；無乳頭溢液的患者可以進行保乳手術(BCT)。腫瘤直徑過大但是主動要求保乳的腫瘤患者，可選擇嘗試2～4 d的新輔助化療，如腫瘤直徑經化療縮小，并且在手術切除腫瘤后乳房外觀影響不大，可以進行保乳手術(BCT)。有國外研究顯示，腫瘤≤3 cm、D>2 cm、腋淋巴結陰性、淋巴管內無癌細胞浸襲的乳腺癌患者可進行保乳手術BCT治療，且隨訪未見復發[16-19]。保乳手術BCT禁忌包括：病灶直徑>4 cm，邊界不清晰者；伴有腋窩淋巴結明顯腫脹或臨床判定疑似有淋巴結轉移者；癌瘤位于乳頭、乳暈者；病灶呈現多中心或多散發惡性鈣化灶；胸部或乳腺曾經有放療記錄者；存在膠原性血管疾病者。乳腺癌患者若處在妊娠期必須禁止采用化療。術中切除的乳腺組織標本經多次病理科檢驗呈陽性者，在實行保乳手術BCT同時還應進行前哨淋巴結的活檢SLNB。早期浸潤性乳腺癌患者預后，腋窩淋巴結是否被侵襲成為患者經手術治療后，是否進行下一步全身治療或其他輔助放療的標準。大量數據和臨床實踐表明，前哨淋巴結活檢呈陰性的乳腺癌患者，進行淋巴結清掃不能提高病人生存幾率，但可能引起患者上肢淋巴結水腫、疼痛和皮下積液等并發癥。因此前哨淋巴結活檢呈陰性的患者，已不再進行淋巴結清掃[16]。保乳手術不僅遏制疾病發展，還可提高患者生活質量，讓女性身心得到健康發展。根據英國國家衛生和臨床技術優化研究所(NICE)報道，雙膦酸鹽已被大范圍應用于乳腺癌骨轉移的并發癥治療，雙膦酸鹽能夠預防乳腺癌骨轉移患者出現SREs。隨著研究進展，以內分泌治療為基礎的聯合治療已進入新時代，CDK4/6是驅動HR+乳腺癌增值的關鍵酶，內分泌聯合CDK4/6抑制劑的治療方案能夠克服耐藥性、增大內分泌治療效果，已成為ER+/HER2-晚期乳腺癌的標準治療方案[20]。所有乳腺癌類型中最常見的是激素受體(HR)呈陽性的乳腺癌，內分泌治療對其有很大效果。據國內外科學家研究表明，雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)均陽性的乳腺癌患者術后再進行內分泌治療有效率高達80 %。但是ER和PR都陰性的患者，術后進行內分泌治療有效率<10 %，這表明ER和PR的性質直接決定內分泌治療是否有效[21]。內分泌治療與靶向治療聯合的實驗也在不斷嘗試，Tifany研究來曲唑聯合抗VEGF抗體貝伐珠單抗治療轉移性乳腺癌(MBC)的安全性是可行的[19]?；颊呓^經前內分泌治療藥物和絕經后藥物有所不同，前者主要為芳香化酶抑制劑包含非甾體類(阿那曲唑)和甾體類(依西美坦)，后者主要為他莫昔芬、LHRH類似物(戈舍瑞林)。隨著研究的進展，乳腺癌治療用藥趨于多樣性，還包括一些中藥的應用，例如參芪扶正注射液。防己黃芪湯對乳腺癌術后的治療與恢復有較好效果,能夠緩解患者疼痛和肢體水腫等情況,安全性較高[22]。

4 RHBDD1與乳腺癌的關系

最新研究發現，rhomboid蛋白酶與乳腺癌的發生和發展密切相關。研究人員使用組織微陣列聯合免疫組化技術對乳腺癌及癌旁組織中RHBDD1的表達水平進行檢測發現，在乳腺癌組織中，RHBDD1的表達量高于瘤旁正常乳腺組織；RHBDD1的表達水平與病理性腫瘤(pT)分期、PR相關，病理性腫瘤-淋巴結轉移(pTNM)分期和雌激素受體(ER)表達相關、與HER2及P53表達無明顯相關。RHBDD1基因上調與幾種乳腺癌亞型的預后不良有關，RHBDD1基因敲除能夠加快乳腺癌細胞的凋亡進程，并能降低乳腺癌細胞增殖過程。RHBDD1敲除后，乳腺癌細胞的運動能力、遷徙能力以及侵襲能力減弱；RHBDD1對乳腺癌細胞的細胞周期積累效應并無影響，但可以調控乳腺癌細胞周期進展；RHBDD1缺失通過蛋白酶體途徑明顯抑制p-Akt活化和降低CDK2表達水平，從而抑制細胞周期運轉和G1|S期轉變。在乳腺癌組織中，RHBDD1和p-Akt蛋白表達水平呈正相關，RHBDD1和CDK2蛋白水平表達也呈正相關。因此RHBDD1可以作為乳腺癌患者一個新型的分子標志物，為乳腺癌的治療提供一個全新的預后指標和研究方向[23-25]。

研究發現乳腺癌組織和細胞中miR-138-5p水平降低。乳腺癌細胞中的熒光素酶報告基因測定證實RHBDD1為miR-138-5p直接靶標。提升RHBDD1在乳腺癌組織中的表達量，miR-138-5p的表達量則降低，呈負相關。高表達miR-138-5p可下調RHBDD1表達，但RHBDD1過度表達逆轉了miR-138-5p對乳腺癌細胞遷移，侵襲細胞上皮-間質轉化(EMT)的抑制作用。研究表明miR-138-5p通過靶向RHBDD1調節乳腺癌遷移的腫瘤抑制作用，說明miR-138-5p負調節EMT可能是乳腺癌的治療靶點[26]。有研究表明，RHBDD1在不同乳腺癌組織病理中表達不同，浸潤性導管癌的表達水平高于小葉原位癌。RHBDD1在乳腺癌導管上皮和癌細胞中高表達。研究發現RHBDD1-mRNA在乳腺癌中的水平增高，且轉移組中其含量高于未轉移組[27]。

5 結語

RHBDD1是一類含有Rhomboid結構域的蛋白家族，本質為膜內絲氨酸蛋白酶，是腫瘤細胞增殖和凋亡的調節劑。已有研究證實，RHBDD1與人類癌癥密切相關，本綜述主要探討了RHBDD1參與乳腺癌的生發過程。RHBDD1可以作為乳腺癌的一個新治療靶點。隨著科技的進步和大量學者的參與，更多關于RHBDD1與乳腺癌關系的研究正在不斷發展中，需要研究者探索、研發進一步深入。