氟化鈉對心肌細胞LC-3、Beclin-1、STAT-3表達的影響*

閆 爍，馬寶慧

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院2018級研究生，內蒙古 包頭 014040；2.內蒙古科技大學包頭醫學院生理學教研室；3.內蒙古科技大學包頭醫學院神經科學研究所)

氟是一種廣泛存在于自然界中的元素，通常以化合物形式存在。人體攝入氟的主要來源包括飲水、飲茶、燃煤等，不同地區的人攝取氟的途徑各不同。一定量的氟對人體有益，如預防齲齒。但是，當氟積累到一定程度后就會對全身各個器官造成損傷，包括骨相損傷和非骨相損傷。全世界有50多個國家和地區都存在氟化物超標的問題[1]。越來越多的研究表明，氟化物在體內積累，對心血管等許多系統產生毒害作用，從而導致心室舒張功能障礙、外周血管疾病、主動脈粥樣硬化和缺血性心臟病[2]。

目前研究證實，過量攝入氟化物會對人體造成傷害，因此對其損害機制的研究就變得尤為重要。研究表明，過量氟化物的攝入會引起細胞內活性氧的產生，過氧化損傷不僅能夠通過活性氧的直接作用造成腎損傷，還能導致下游凋亡、自噬等多種生物學行為。組織器官功能的損傷過程不僅涉及細胞過度凋亡，同時還與細胞過度自噬密切相關[3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調節自噬過程最重要的上游信號分子。缺氧、氧化應激、中毒等外界刺激可激活mTOR信號通路所介導的細胞自噬過程，增加哺乳動物ATG6同源蛋白(Beclin-1)的表達，并與多種Atg分子相互作用，參與自噬體的形成。微管相關蛋白1輕鏈3(LC-3)是自噬過程激活的標志分子，自噬未激活時，LC-3及LC-3Ⅰ為主要存在形式，自噬激活時，LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉化。信號轉導與轉錄激活因子3(STAT-3)可以被不同的細胞因子激活，在細胞因子-受體相互作用的過程中充當載體，在細胞的生長、分化中起著重要作用。在生理性自噬過程中，細胞利用自身的溶酶體來降解受損的細胞器及大分子，既能清除損傷的大分子及細胞器，又能通過降解產物為細胞供能。但外界損傷因素的持續存在會造成自噬過程持續激活，進而造成細胞發生損傷。本文利用大鼠H9c2心肌細胞建立氟中毒模型，研究不同濃度的氟化鈉對心肌細胞中自噬相關基因的變化。

1 對象與方法

1.1實驗材料及分組 選用大鼠H9c2心肌細胞，購于北京協和醫學院細胞資源中心國家實驗細胞資源共享服務平臺。H9c2心肌細胞分為6組，分別為0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L NaF組，各組均用相應的培養基培養48 h。

1.2方法 樣品中加入200 μL的Trizol，勻漿研磨成無顆粒狀，再以加入80 μL Trizol的針管來回抽吸，靜置5 min，4 ℃，12 000 g離心5 min。取上清加氯仿，4 ℃，12 000 g離心15 min。取上清加等比例異丙醇，4 ℃，1 000 g離心5 min。棄上清加預冷的75 %乙醇1 mL，4 ℃，10 000 g離心5 min。棄上清4 ℃，7 500 g空轉1 min。加入20 μL dd H2O溶解RNA，震蕩、離心，測定RNA濃度。反轉錄得到cDNA，于PCR儀擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗。LC-3、Beclin-1、STAT-3 mRNA表達分析采用Tanon-500全自動化學發光圖像分析系統。

1.3實驗儀器及試劑 Nanodrop-2000微量核酸蛋白定量儀(美國Thermo Scientific)，2×Taq PCR預混試劑Ⅱ(天根)，PCR儀(美國Thermo Scientific)，Trizol細胞裂解液，氯仿，異丙醇，75 %乙醇，Thermo反轉錄試劑盒(美國Thermo scientific)。

1.4統計分析 所有數據采用SPSS 20.0進行分析。計量資料以(均數±標準差)表示，采用單因素方差分析進行統計，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1氟化鈉對心肌細胞LC-3、Beclin-1 mRNA表達的影響 將H9c2心肌細胞加入含有NaF的培養基培養48 h后，心肌細胞LC-3和Beclin-1 mRNA表達量隨培養基中NaF濃度的增加而增加，見圖1-a、1-b。

圖1 氟化鈉處理心肌細胞48 h后LC-3 mRNA、STAT-3 mRNA、Beclin-1 mRNA表達量的變化

2.2氟化鈉對心肌細胞STAT-3 mRNA表達的影響 H9c2心肌細胞在染毒處理48 h后，STAT-3 mRNA表達量隨培養基中NaF濃度的增加而減少，見圖1-c。

3 討論

氟是鹵族元素中化學性質較活潑的元素之一，是機體必需的微量元素，具有強負電性、高度破壞性。過量的氟可對機體軟組織系統造成損傷。心肌是氟中毒非骨相損傷非常重要的靶器官之一。越來越多的證據表明，心血管系統易攝入過量的氟化物，導致嚴重的功能障礙，例如心輸出量下降，誘發心律不齊和心臟傳導阻滯[4]。高濃度的氟化物可引起心肌細胞損傷，導致心室舒張功能障礙、周圍血管疾病、頸動脈粥樣硬化和缺血性心臟病。然而，人們對氟中毒致心血管疾病發生的作用機制尚不清楚。我們前期的實驗結果表明，染毒的心肌細胞活力降低。

自噬是近年來生命科學領域研究的熱點。自噬是細胞通過一系列復雜過程將自身組成成分或外來入侵者進行消化的過程，是細胞維持穩態、抵抗逆境的一個重要機制。自噬是機體細胞的一種程序性死亡方式，也稱為Ⅱ型程序性死亡，參與細胞增殖、生長、凋亡、維持細胞內環境穩態。LC-3是哺乳動物細胞中自噬體的標記蛋白，是目前觀察自噬現象是否存在，研究細胞自噬較為可靠的生物學標志物[5]。在哺乳動物細胞內，LC-3與ATG8是同源基因，LC-3的表達水平越高，則自噬水平越高。哺乳動物中Beclin-1是參與自噬的另一種特異性基因，其與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(class-3-PI3K)形成復合物，從而參與自噬體的形成[6]。正常情況下，機體的自噬水平處于較低的范圍，當機體受到某種刺激或處于應激狀態時，即被誘導發生自噬。不同程度的自噬對細胞的作用有很大區別，當自噬發生程度低時自噬會對細胞產生保護作用，而過度自噬發生時會對細胞造成損傷[7]。本實驗以H9c2大鼠心肌細胞為實驗材料，將H9c2細胞分別加入到含有2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L NaF的培養基中培養48 h后，H9c2心肌細胞中LC-3和Beclin-1 mRNA表達量隨NaF濃度的增加而增加，且高于對照組。徐淋等[8]研究顯示，氟中毒大鼠肝臟中LC-3、Beclin-1、B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、B細胞淋巴瘤/白細胞基因伴隨蛋白x(Bax)的蛋白表達水平明顯高于對照組，說明過量氟可激活大鼠肝組織中自噬和凋亡因子，自噬和凋亡可能共同參與慢性氟中毒所致肝臟損傷的發病過程。以前研究表明，細胞凋亡可能參與氟中毒引起的心肌細胞損傷，推測在氟致心肌細胞損傷時還有自噬的參與。

STAT-3是STATs家族的重要成員，也是細胞因子和生長因子信號途徑的介導子。STAT-3廣泛表達于不同類型的細胞和組織中，參與細胞生長分化、增生、惡性轉化及凋亡抑制等生理功能的調控[9]。劉亞麗等[10]及俞辰斌等[11]研究顯示，STAT-3是調控細胞生長、分化的重要因子，缺血再灌注損傷的心肌細胞及氧化應激損傷的心肌細胞p-STAT3表達下調，激活大鼠心肌細胞JAK2/STAT3信號通路能夠抑制心肌細胞凋亡，發揮心肌細胞的保護作用，阻斷STAT3的激活則增加細胞凋亡，細胞活力明顯下降。在本實驗中，STAT-3 mRNA表達量隨NaF濃度的增加而降低，低于對照組，表明過量的氟可誘導自噬產生，同時在細胞生長、分化中起著重要作用的STAT-3相對表達量下降，我們推測氟中毒可能引起自噬從而使心肌細胞活力降低。

綜上所述，過量的氟化物上調心肌細胞LC-3、Beclin-1 mRNA表達量，并下調STAT-3 mRNA表達量，推測氟化鈉導致心肌細胞活力降低可能與自噬的過度激活有關。