內皮蛋白C受體對類風濕關節炎疾病進展的影響*

劉匯洋，劉軒綺，白靜茹，趙京洋，尹芳蕊，王永福

(1.包頭醫學院第一附屬醫院，內蒙古 包頭 014010；2.包頭醫學院)

類風濕關節炎(Rhreumatoid Athritis，RA)是一種慢性全身性炎癥性自身免疫性疾病，主要特征為滑膜組織內有大量浸潤的炎性免疫細胞，并釋放細胞因子及趨化因子，導致持續的滑膜炎癥，增強軟骨細胞分解代謝和破骨細胞生成，最終導致骨侵蝕、骨破壞[1]。目前的研究證實炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)、JAK/STAT途徑信號轉導通路的細胞因子以及共刺激信號途徑(包括APC表面的B7家族分子以及T細胞表面的CD28/CTLA-4分子)等在RA的發病過程中發揮重要作用[2-4]。通過對RA的發病機制研究的積累，人們發現抑制相關炎癥因子的表達以及通路激活可以為RA的治療提供新的思路。在早期研究中，內皮細胞蛋白C受體(Endothelial protein C receptor，EPCR)是內皮細胞的特異性跨膜蛋白，能與蛋白C(Protein C，PC)、活化蛋白C(Activated protein C，APC)，凝血因子VIIa(factor VIIa，FVIIa)等配體結合發揮抗凝及細胞保護作用[5]。EPCR分為膜結合型EPCR(Membrane-bound EPCR，mEPCR)和可溶性EPCR(Soluble EPCR，sEPCR)兩種類型，mEPCR表達于內皮細胞表面，與PC特異性結合激活蛋白C發揮抗凝及抗炎作用，mEPCR被炎癥因子和凝血酶降解后釋放入血，即形成sEPCR[6]。已經有研究指出在RA患者的外周血和滑膜組織中可以檢測到sEPCR和mEPCR的異常表達[7-8]；并且在CIA小鼠的體內實驗證實，EPCR能夠調節Th17細胞的分化，參與RA的疾病進展[8-9]。但目前尚未明確兩種類型的EPCR的異常表達是否會影響疾病的發展，以及二者的對疾病影響的差異，因此本文進一步研究了sEPCR與mEPCR在RA疾病進展中的作用。

1 材料與方法

1.1EPCR的結構及表達情況分析 通過Gene Expression Ominibus(GEO)數據庫，對人類可溶性EPCR和膜型EPCR的基因結構差異進行分析(NCBI參考序列：NM_006404.5)；使用人類蛋白質圖譜(The Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org/)數據庫，分析EPCR在組織和細胞上的表達情況；并通過整理GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，分析RA、骨關節炎(Osteoarthritis，OA)患者和健康個體關節滑膜EPCR的表達差異。來自正常人的10個關節滑膜樣本(GSM1332201、GSM1332202、GSM1332203、GSM1332204、GSM1332205、GSM1332206、GSM1332207、GSM1332208、GSM1332209、GSM1332210)，OA患者的10個關節滑膜樣本(GSM1332211、GSM1332212、GSM1332213、GSM1332214、GSM1332215、GSM1332216、GSM1332217、GSM1332218、GSM1332219、GSM1332220)，以及RA患者的10個關節滑膜樣本(GSM1332221、GSM1332222、GSM1332223、GSM1332224、GSM1332225、GSM1332226、GSM1332227、GSM1332228、GSM1332229、GSM1332230)分析RA、OA以及健康個體滑膜上EPCR的表達差異。

1.2動物及試劑 雄性DBA1小鼠(8周齡)購自南京大學動物模型研究中心。CIA造模成功后將小鼠隨機分為5組：空白組(n=5)，CIA組(n=5)，空載體組(n=5)，sEPCR組(n=5)，mEPCR敲減組(n=5)。用于體內實驗的EPCR重組蛋白購自Sino Biological(中國北京)，EPCR腺病毒小干擾載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司，牛Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)和弗氏完全佐劑(CFA)購自Chondrex(美國華盛頓州雷德蒙德)。

1.3CIA誘導 根據標準方案誘導CIA小鼠。將2 mg/mL的牛Ⅱ型膠原溶于10 mM乙酸中，溫和攪拌，終濃度為4 mg/mL，4 ℃過夜，然后用等體積的完全弗氏佐劑乳化(含4 mg/mL結核分枝桿菌)。隨后將100 μL乳化的Ⅱ型膠原于DBA1/J小鼠尾根部2 cm處皮內注射。21 d后，重復該過程進行加強免疫建立CIA小鼠模型[10-11]。

1.4EPCR體內干預策略

1.4.1可溶性EPCR的體內干預 為了研究EPCR表達上調是否可以預防或緩解關節炎，在首次免疫后，參考Meilang Xue等人的研究，對CIA小鼠以0.5 mg/kg的劑量每周兩次進行腹腔內注射sEPCR重組蛋白[8, 12]，直至加強免疫，構建可溶性EPCR干預模型。

1.4.2EPCR小干擾載體的體內干預 為進一步證實EPCR在RA疾病進展中的作用，小鼠首次免疫后，以1×109PFU/20g的劑量對EPCR敲減組小鼠進行每周一次的腹腔內注射EPCR小干擾載體[13]，下調CIA小鼠EPCR的表達，直至加強免疫。

1.5臨床癥狀評估 加強免疫后第7 d，對CIA小鼠的關節進行連續評分，標準如下：4=從踝關節到整個爪的腫脹和(或)紅；3=2個以上的關節腫脹和(或)紅；2=累及2個關節的腫脹和(或)紅；1=1個腳趾關節的紅色斑點或腫脹；0=正常。每只小鼠的關節評分是四肢評分的總和，最高為16分。

1.6組織病理學分析 在第28 d 處死CIA小鼠，并進行組織學和放射學評估。用錐形束掃描儀(SkyScan 1176；高分辨率體內X射線顯微斷層掃描儀，德國布魯克生物公司)獲得后肢的微型計算機斷層掃描平片。之后分離小鼠后肢，并將關節固定在福爾馬林中，對標本進行進行石蠟包埋處理，組織切片用蘇木素-伊紅染色(HE染色)和甲苯胺藍染色(TB染色)。根據滑膜組織中炎性細胞浸潤數量、蛋白多糖損失的程度以及關節軟骨破壞、骨侵蝕的程度對關節的組織病理學變化進行評分，評分范圍分別為0～3[10, 12]。

2 結果

2.1mEPCR和sEPCR結構差異以及EPCR在細胞、組織上的表達差異 目前的研究證實，金屬蛋白酶ADAM17是導致mEPCR脫落產生sEPCR的主要切割酶，通過對GEO數據庫的整理發現了兩種EPCR的結構差異，經ADAM17剪切，sEPCR較mEPCR缺少了跨膜區(圖1A)。EPCR 存在于多種臟器及組織，如肺臟、腎臟、脾、皮膚等(圖1B)，同時，本研究發現EPCR廣泛表達于各種細胞，如單核細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、T細胞和心肌細胞等(圖1C)。此外，通過對GEO數據庫中EPCR在RA患者滑膜組織中的表達水平進行整理，結果顯示在健康個體、RA患者及OA患者的關節滑膜中存在EPCR的表達差異(圖1D)，與健康人群相比，RA及OA患者滑膜中EPCR的表達明顯下降。見圖1。

圖1 mEPCR和sEPCR結構差異以及EPCR在細胞、組織上的表達差異

2.2通過sEPCR干預可以緩解CIA小鼠的臨床癥狀 為了研究可溶性EPCR在RA中的作用，本研究給予CIA小鼠0.5mg/kg的可溶性EPCR進行體內實驗。對小鼠關節進行連續評分可以看出，相比對于對照組，sEPCR可溶性蛋白干預后，CIA小鼠的關節評分明顯降低(圖2A)；沒有給予干預措施的CIA小鼠有明顯的關節紅腫，而給予sEPCR治療后，小鼠四肢關節僅表現為輕度的紅腫(圖2B)。在加強免疫后第28 d處死小鼠，并分離后肢，獲得micro-CT(圖2C)，結果顯示空白對照組小鼠關節間隙清晰，邊緣光滑，沒有明顯的骨質破壞，而CIA小鼠關節間隙明顯狹窄，并有一定程度的骨侵蝕和關節變形，圖2C右側為給予sEPCR干預的CIA小鼠關節micro-CT，可以看到雖然有一定程度的骨破壞，但相比對照組明顯減輕。上述結果表明，sEPCR表達的上調可以減輕炎癥反應，保護關節的完整性并防止關節變形，延緩RA的疾病進展。見圖2。

圖2 sEPCR干預后CIA小鼠的關節評估

2.3mEPCR表達下調加重CIA小鼠的臨床癥狀 為了進一步研究mEPCR對RA疾病進展的影響，給予小鼠注射EPCR空載體作為陰性對照，實驗組CIA小鼠腹腔注射EPCR小干擾載體下調CIA小鼠的mEPCR表達，并對小鼠進行關節評分。結果表明，相比空載體干預對照組小鼠，EPCR表達下調后小鼠關節評分顯著升高，并且可以看到EPCR表達下調組CIA小鼠相比對照組，四肢關節腫脹明顯(圖3A-B)。同樣，對兩組小鼠進行了Micro-CT檢查，結果顯示(圖3C)，EPCR表達下調后，有顯著的骨侵蝕和骨破壞，關節間隙狹窄也更為嚴重。以上結果表明，mEPCR可能對關節有保護作用，其表達下調會加重RA的關節表現，導致RA病情加重。見圖3。

圖3 mEPCR表達下調CIA小鼠的關節評估

2.4sEPCR干預緩解 CIA小鼠的骨侵蝕 對CIA小鼠的關節進行了HE染色和甲苯胺藍染色。圖4A為小鼠關節的HE染色。左側為空白對照組，可以看到關節軟骨表面光滑整潔，軟骨細胞排列整齊，分布均勻，染色均一，軟骨下骨染色均勻，與軟骨分界清晰；而CIA對照組關節破壞明顯，有明顯的軟骨及骨侵蝕，軟骨連續性中斷，骨與軟骨界限模糊，高倍鏡下可見到軟骨層變薄，細胞排列紊亂，毀損嚴重；右側為sEPCR干預組小鼠的關節，可以看到軟骨細胞分布相比CIA對照組小鼠較為均勻，骨和軟骨的破壞明顯減輕。圖4B圖為小鼠后肢關節的甲苯胺藍染色。左側為空白對照組，可以看到紫藍色為軟骨基質，主要成分為蛋白多糖；中間為CIA組，可以看到關節間隙變窄，軟骨染色基質染色較淺，面積減小，蛋白多糖丟失和滑膜浸潤明顯，軟骨和骨侵蝕較重；而給予sEPCR干預后，關節間隙狹窄、骨和軟骨破壞得到顯著改善，蛋白多糖的丟失較CIA對照組減少。圖4C為根據蛋白多聚糖的丟失情況以及關節破壞情況對各組小鼠的后肢關節進行組織學評分。這些結果表明，sEPCR表達上調可以減少炎性細胞的浸潤，保護關節的完整性，減少骨和軟骨的破壞，控制RA疾病病情的發展。見圖4。

圖4 給予sEPCR重組蛋白干預后，二次免疫結束后第28 d的結果

2.5EPCR小干擾載體的干預加重CIA小鼠的骨破壞 給予CIA小鼠EPCR小干擾載體干預后，對小鼠關節進行組織學評估。圖5A為小鼠后肢關節的HE染色，結果顯示，相比陰性對照組以及給予空載體干預的CIA小鼠，給予EPCR小干擾載體后，關節軟骨層完整性被破壞，軟骨細胞分布不均，軟骨下骨侵蝕加重，關節間隙狹窄明顯。對關節進行甲苯胺藍染色結果顯示，EPCR敲減組小鼠關節的軟骨及骨破壞較對照組小鼠更為嚴重，軟骨基質染色面積減小，蛋白多糖丟失增加(圖5B)。圖5C為對關節的組織病理學評分。綜上，給予EPCR小干擾載體干預后，mEPCR表達降低而導致CIA小鼠表現為明顯的關節炎癥，包括炎癥細胞浸潤和蛋白多聚糖丟失增加以及更為嚴重的骨和軟骨侵蝕，也就是說，mEPCR表達下調能夠介導RA疾病加重。見圖5。

3 討論

mEPCR主要表達于細胞內皮表面，可以與PC結合，進一步活化PC，發揮抗凝及細胞保護作用；EPCR釋放入血后，形成sEPCR，可以結合PC抑制APC的產生，或與APC結合阻斷APC的細胞保護功能[14]。在以內皮細胞功能障礙為特點的自身免疫性疾病中可檢測到sEPCR的水平升高，在系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者的外周血中可檢測到sEPCR水平明顯增加，尤其以累及腎臟的患者為著，可以作為血管損傷的標志物[15]。Faioni, E等人[16-17]的研究顯示在炎癥性腸病患者中，sEPCR的水平明顯增高，但在疾病靜止期與活動期sEPCR的水平沒有明顯差異，相反，mEPCR的水平是降低的，這使得PC通路受阻，APC活化減少，炎癥加重。本文通過對GEO數據庫的整理發現，在RA患者的滑膜組織中也存在EPCR的異常表達，其表達水平顯著低于健康對照組，因此我們提出EPCR的表達下調能否介導RA疾病進展。我們的實驗通過給予小鼠腹腔內注射EPCR敲減載體，使CIA小鼠mEPCR表達水平下調，發現小鼠四肢關節紅腫程度加重，進一步的組織病理學分析同樣驗證了上述觀點。

此外，EPCR可以介導APC通過抑制單核細胞的遷移以及NF-κB信號轉導和TNF-α等促炎因子產生[7, 18-19]。NF-κB是RA滑膜細胞中誘導炎癥介質的一個重要的細胞內信號通路，[20-21]因此抑制NF-κB的激活和炎癥因子的釋放，可以有效控制炎癥；EPCR還能夠通過調節Th17細胞的分化[8, 22]，發揮抑炎作用，減少骨和軟骨的破壞，因此EPCR水平的升高可能會對RA的異常免疫和炎癥起到保護作用。我們推測RA患者表現的炎癥反應可能與EPCR表達降低有關。Meilang Xue等人的研究指出[7]，在給予CIA小鼠EPCR或APC處理后，觀察到小鼠的關節癥狀可以得到明顯的改善。我們通過給予CIA小鼠體內注射sEPCR重組蛋白上調小鼠sEPCR的表達，觀察到小鼠關節炎癥狀得到了一定程度的控制，骨破壞和骨侵蝕相應減輕。

有研究指出，T細胞表面的EPCR可與免疫共分子協同表達，如PD-1/CTLA-4及ICOS等。抑制炎癥的新型生物制劑阿巴西普(abatacept，CTLA-4Ig融合蛋白)是一種共刺激抑制劑，與其他的生物制劑相比較，它可以在炎癥級聯反應的上游發揮作用。研究指出共刺激抑制劑可以與APC表面的B7分子結合，干擾B7-CD28協同共刺激途徑，從而阻斷T細胞活化，控制RA炎癥并改善關節破壞[23-25]。進一步的研究顯示sEPCR能夠抑制Th17細胞分化，并影響Th17/Treg細胞的比例，這一過程能夠參與RA的疾病進展。

綜上所述，可溶性和膜型EPCR的異常表達對RA的疾病進展具有重要作用，其中sEPCR的表達上調可以減慢疾病進展；相反，mEPCR表達下調會加重RA病情。這一現象提示，EPCR具有作為一種新型的RA的治療干預靶點的應用潛力。