NgR基因沉默神經干細胞和雪旺細胞-PLGA移植于創傷性腦損傷大鼠皮層對神經功能恢復的作用*

李丹霞，童康強，張曉璐，周佳林，韓建國，韓彥軍，邵 國，張春陽

[1.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院，內蒙古 包頭 014010；2.包頭醫學院神經外科疾病研究所(轉化醫學)；3.內蒙古自治區骨組織再生與損傷修復工程技術中心]

創傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)一直是各年齡段發病率、致殘率和死亡率的主要原因之一，雖然最初的腦損傷涉及急性和不可逆的原發性腦實質損傷，但隨后的繼發性腦損傷通常會在數月至數年內緩慢進展，因此為治療干預提供了一個窗口[1]。目前已經證實干細胞移植能夠促進腦損傷的功能恢復，而聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)有承載細胞的能力[2]。研究神經修復機制中發現NgR(Nogo receptor)信號傳導通路是其中一條重要的機制[3]，通過抑制NgR的表達，使軸突生長抑制受限，促進受損的神經結構和功能恢復。根據這些發現，我們運用組織工程學方法，將NgR基因沉默的神經干細胞(neural stem cells, NSC)和雪旺細胞(Schwann cells,SC)-PLGA復合體移植至創傷性腦損傷大鼠皮層損傷區，觀察移植復合體在大鼠皮層損傷區通過改變局部微環境促進神經元的存活、軸突再生及功能恢復情況。

1 材料與方法

1.1材料 健康成年雌性Lewis大鼠48只，體重約250g。PLGA(廣州創賽生物醫用材料有限公司)，DEME培養基、胎牛血清(廣州濟恒醫藥科技有限公司)，兔抗鼠NgR基因抗體、山羊抗兔抗體(武漢博士德公司)；慢病毒載體構建(漢恒生物科技有限公司)；HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；NeroTMTransfection系統(賽默飛世爾生命科技有限公司)；電子顱腦損傷儀(e CCI Model-6.3，Custom Design & Fabrication，Inc，美國)；顯微器械(上海金鐘)。

1.2方法

1.2.1細胞準備 取E12.5 d孕母鼠胚胎，獲取端腦，并分離、純化、擴增神經干細胞和雪旺細胞，沉默NgR基因由美吉生物公司設計并合成，根據生產商的說明，使用NeroTMTransfection系統，在35 mm培養皿中用shRNA-NgR轉染神經干細胞和雪旺細胞。并篩選出表達shRNA-NgR的神經干細胞和雪旺細胞，進行傳代、擴增。

1.2.2細胞支架復合體的制備 PLGA經疏水蛋白HFBI和Ⅰ型膠原聯合修飾后，將其剪裁成2.5 mm×1.5 mm×1.5 mm的支架，真空干燥并消毒。Ⅲ組吸取4×1 010個/L的NSC和SC各10 μL至PLGA支架內；Ⅳ組用吸取4×1010個/L的NgR基因沉默的NSC和SC各10 μL至PLGA支架。根據制造商說明，將PLGA支架復合體置于培養基中 溫育24 h后，然后在37 ℃，5 %CO2濕潤的培養箱中再孵育24 h。

2.1改良大鼠神經功能缺損評分(mNSS) 結果顯示，與Ⅰ組比，Ⅱ組神經功能評分明顯升高(P<0.05)；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組神經功能評分明顯下降(P<0.05)，且Ⅳ組優于Ⅲ組接近于Ⅰ組(P<0.05)。見表1。

1.2.3分組和TBI造模 隨機將大鼠分為4組，每組12只，正常對照組(Ⅰ組)、單純PLGA移植組(Ⅱ組)、神經干細胞+雪旺細胞+PLGA復合體移植組(Ⅲ組)、沉默NgR基因+神經干細胞+雪旺細胞+PLGA復合體移植組(Ⅳ組)。術前將大鼠置于在有自然光安靜的房間內適應一周，直至不再有害怕的表情(蜷縮、尿頻、便頻、尖叫)。禁食水8 h后，用5 %的氯胺酮對大鼠腹腔注射麻醉，麻醉成功后，俯臥位固定，置于立體定向儀上，剪除毛發，消毒后沿正中線切開頭皮，暴露右側頂骨，矢狀縫向右旁開1.5 mm,冠狀縫向后1.5 mm,磨一直徑約5 mm的骨窗，暴露硬腦膜并保持硬腦膜完整。對Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠行eCCI打擊建立經典顱腦損傷動物模型[3]。設置打擊參數：深度2 mm,速度5 m/s,錘擊時間100 s。然后剪開硬腦膜，Ⅱ組于損傷區植入單純PLGA支架，Ⅱ組于損傷區植入單純PLGA支架，Ⅲ組于損傷區植入神經干細胞+雪旺細胞+PLGA復合體，Ⅳ組于損傷區植入沉默NgR基因+神經干細胞+雪旺細胞+PLGA復合體。移植結束后常規縫合大鼠硬腦膜、頭皮。

（4）對于工業控制網絡設備資產的管理與監控能力不足。目前絕大多數的工業控制網絡中并沒有對于其設備資產的管理與監控機制，容易受到攻擊。

1.2.5HE染色和顯微鏡觀察 在造模后1個月處死大鼠，于大鼠皮層損傷區取材，石蠟包埋切片，HE染色，在40倍、200倍、400倍光學顯微鏡觀察。

圓筒段需先進行地基處理再開挖施工，作業面分段提交，考慮到分段提交時作業面較窄，無法投入較多的設備同時施工。計劃投入1艘8方抓斗船（配備有6方小斗），1艘抽砂泵船進行施工， 3區施工時視情況調派水上鉤機協助方樁拔出施工。

1.2.4改良大鼠神經功能缺損評分(mNSS) 于建模后1、2、4周，采用雙盲法對所有大鼠進行神經功能檢測。采用國際通用的改良mNSS神經功能缺損評分檢測，重復檢測3次取其平均值(0～18分)。

2.2神經干細胞的存活及分化情況 造模后1個月HE染色，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組損傷區組織斷裂，有空洞形成；與Ⅱ組比較，Ⅲ組、Ⅳ組移植處的空洞較少；與Ⅲ組比較，Ⅳ組移植處的空洞較少。見圖1。

2 結果

從定義上來看，地理信息生成系統中的數據反映的是空間地理實體位置、屬性和拓撲關系，側重點在于空間信息和屬性信息；地圖制圖中的數據最終會以地圖產品輸出，更側重形象、直觀地描述地球表面的自然地理和社會人文等要素。

表1 不同組別大鼠改良mNSS評分

圖1 各組小鼠損傷區組織HE染色

3 討論

人類中樞神經系統存在具有自我更新能力和多向分化潛能的神經干細胞，而具有再生能力的NSC發揮功能與干細胞微環境和自身的基因表達存在密切聯系。SC可合成和釋放生物活性因子，誘導神經元生長錐生長、軸突生成。NSC向神經元的分化率很低，且神經元的軸突生長方向不易控制。研究表明在神經損傷后的NSC能夠在具有適宜微環境的移植物中生長、分化、增殖[4-5]。因此，移植后的神經干細胞修復受自身基因的表達和微環境的影響。NgR是成人中樞神經系統中限制神經元再生的主要分子，Nogo蛋白通過與NgR結合可導致生長錐塌陷并抑制神經元軸突的延伸[6]。有動物實驗發現Nogo蛋白能促進臂叢神經斷裂的再生[7]。Hu等[8]研究也顯示了Nogo在背根神經節神經元的調節中起重要作用。Solomom等[9]發現了通過抑制NgR信號傳導能促進視神經損傷后軸突的重新伸展。最近的研究發現，通過對TBI小鼠進行NgR的調控，可以影響小鼠的記憶、認知和情緒，對于NgR過表達的小鼠出現了海馬依賴性損傷，表明了NgR是突觸形成的調控因子，能穩定和塑造記憶功能[10]。這些研究均表明了NgR在神經元的再生中有重要作用。NgR基因的敲除，為TBI的治療提供了一個靶點。通過慢病毒載體轉錄，產生NgR抗體，阻止NgR對神經元再生的抑制，可促進NSC軸突再生[11]。

NSC能增加神經元的數量，SC能夠分泌各種營養因子，為神經元的生長提供合適的環境，而對NgR進行抑制能促進軸突生長，因此，將三者相結合，可能更有助于中樞神經損傷的修復，其效果可能大于單一修復。但是如何將三者完美結合，亦是一個必須面對的課題。有學者將NSC或SC移植于周圍神經或脊髓損傷區，但是很多情況下受損區域只是被雜亂無章的膠質瘢痕所取代[12]，其原因可能是損傷后的干細胞缺乏誘導，無法控制軸突生長方向，導致其無法定向生長，幾乎對神經修復不產生作用。而組織工程技術應用恰恰能對解決這一問題提供幫助。組織工程的核心是用生物材料構建出細胞和組織的替代品并且促進生物功能的恢復[13]。生物材料提供了一個細胞貼附、增殖、分化的可調控的三維立體微環境[14]。常見的組織工程支架PLGA能給細胞定向生長提供一個框架，阻止其雜亂生長，通過調整支架的形狀達到預想的生長方向。已有研究將NSC移植于PLGA中，發現PLGA確實能引導NSC的生長，但是其中存在著各種各樣的問題，較為常見的是如何使移植細胞在PLGA上貼壁生長[15]。最新的研究發現了一種天然生物聚合物貼附蛋白(mussel adhesive protein，MAP),由于其獨特的粘合作用，賦予細胞粘附，細胞增殖和生物相容的性能，解決了傳統的聚合物使細胞貼附困難的問題[16]。

繪制符號首先要從其外觀上進行設計，從路燈符號角度來講，其結構很簡單，主要是由一個燈桿和燈泡組成。在設計時，燈桿和燈泡盡可能簡單明了。本文給出了一個燈桿和2個球體燈泡的設計樣式，如圖2所示。

本研究將NgR基因沉默的NSC和SC聯合移植于創傷性腦損傷大鼠皮層損傷區，既增加了神經元的數量，又提供了神經元生長的微環境，并促進了軸突生長。而且又有組織工程支架PLGA，為神經干細胞的生長提供了一個定向生長的空間，避免其雜亂生長，為神經的定向修復提供了保駕。而且在體外培養時，我們發現NSC和SC在PLGA支架上聯合培養比NSC單一培養在PLGA支架上貼壁、分化，增殖更容易，這又大大解決了細胞在PLGA支架上貼壁生長困難這一問題。有研究[17]將NgR基因沉默后的骨髓間充質干細胞和SC移植于大鼠脊髓損傷區,采用組織工程材料提供支架，同時在體外培養，使其形成一個組織工程化的橋接器件，結果發現NgR基因沉默后的聯合移植對脊髓損傷的修復優于NgR基因未沉默的移植。這與本研究將NgR基因沉默神經干細胞和雪旺細胞-PLGA移植于創傷性腦損傷大鼠皮層損傷區促進神經元軸突再生，并有助于運動功能的恢復的研究結果相一致。說明了這種將NgR基因沉默神經干細胞和雪旺細胞聯合移植的方法有助于中樞神經的損傷修復，并且用組織工程材料PLGA支架能夠極大程度上誘導細胞的定向生長，對神經的修復提供助益。本動物實驗結果發現NgR基因沉默，比NgR基因未沉默的神經干細胞和雪旺細胞-PLGA復合體移植對大鼠運動能力的恢復更優，并且組織學結果也有相同的發現。將NgR基因沉默神經干細胞和雪旺細胞-PLGA共移植于創傷性腦損傷大鼠可促進神經修復，可能為人TBI的修復提供了一個可行的研究思路。