肉及肉制品中動物源性成分常見檢測方法研究進展

燕 妮,孫世琨

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730300）

隨著人民生活水平的提高，消費者對肉及肉制品的需求逐年增加，普通的產品已經不能滿足廣大消費者的需求，此時一些優質高蛋白的肉類產品、加工肉制品脫穎而出，因其營養價值高、種類多、食用方便而深受廣大消費者喜愛。肉及肉制品可以提供人類維持生命活動所必需的氨基酸、多種維生素（如維生素B6、B12、維生素D 等）、多種微量元素（鐵、鋅和硒等）以及大量的不飽和脂肪酸[1]。在利益的驅使下，一些不法商家為了牟利將低價肉（雞、鴨等）摻入或冒充高價肉（牛、羊等），市場上肉類摻假現象屢禁不止[2]。目前已經研發了多種檢測方法來鑒別肉類摻假現象，其準確性和高效性逐漸提升，但仍有欠缺，如無法高通量快速檢測等問題。

肉及肉制品中動物源性成分的鑒定方法很多，如近紅外光譜法、酶聯免疫法、聚合酶鏈式反應等。自PCR 技術被廣泛應用于肉及肉制品中動物源性成分的測定以來，基于DNA 的PCR 分析技術也在不斷發展，如環介導等溫擴增技術、AFLP (擴增片段長度多態性)標記法、PCR-RFLP（限制性片段長度多態性）技術、實時熒光PCR 技術、基因芯片技術和DNA 條形碼技術等。本文綜合論述了目前肉及肉制品中動物源性成分的檢測技術，并對有應用前景的新技術做了簡要闡述。

1 理化檢測方法

理化檢測方法主要是利用樣品的光學特性、化學組成等特點檢測不同動物品種的肉類組分。常見的方法有近紅外光譜法、高效液相色譜 法等。

1.1 近紅外光譜法

近紅外光譜法主要利用樣品的光學特性，通過光在樣品中吸收、反射、散射等特點構建待測樣品的特征光譜進而區分樣品種類，是一種快速有效的檢測方法[3]。趙紅波等以近紅外光譜分析技術結合模式判別方法，建立了一種準確、快速鑒別豬肉和牛肉的方法[4]。周嬌嬌等利用近紅外光譜分技術結合化學計量學方法建立了SVM 模型，可以快速鑒別7 種淡水魚品種[5]。白京等應用近紅外漫反射光譜分析技術結合化學計量學方法對羊肉卷中豬肉摻假比例的定量檢測研究，將不同樣品的光譜數據進行建模分析，實現了羊肉卷中豬肉摻假比例的定量檢測[6]。近紅外光譜法操作簡單，快捷、樣品用量少且無損樣品等優點，目前已成功地應用在食品、農業、醫藥等領域。

1.2 色譜質譜聯用技術

色譜質譜聯用技術是通過高分辨質譜技術尋找不同物種的特異性多肽，再利用高效液相色譜-串聯質譜進行定性及定量，該技術因靈敏度高、樣品前處理簡單、可以避免出現假陽性樣品、可同時測定多個物種而廣泛應用在食品檢測中。

Kim 等凝膠電泳結合高效液相質譜聯用技術，尋找四種主要肉類物種的區別標記。利用一維凝膠電泳法分別對各類肉質的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白進行分析，然后通過高效液相質譜聯用進行分析，證實可以利用肌鈣蛋白（TnI）、烯醇化酶、乳酸脫氫酶（LDH）和三磷酸異構酶（TPI）的電泳遷移率不同，可作為不同肉制品區分的標志[7]。Magdalena Montowska等利用雙向電泳技術對目標的六種動物的一部分蛋白質進行分析，發現一類蛋白質在肉類老化變質和加工完成的過程中含量相對穩定，然后通過質譜對這類蛋白質進行定性分析。研究發現以調節蛋白、代謝酶、一些肌原纖維蛋白和血漿蛋白的特定物種的電泳遷移率差異為特征，可以區分肉質的種類[8]。電泳和質譜結合被廣泛運用于鑒別領域，但是存在無法進行高通量分析的缺點。

Sarah 等采用LC-QTOF-MS 方法對冷凍、蒸煮豬肉的胰蛋白酶進行標記，建立MRM 方法進行驗證。發現多反應監測（MRM）能檢測到四種肽，這四種肽在豬肉樣本中始終存在，可以作為從熱加工肉品中鑒定區分出豬肉與牛肉和其他肉類的被標記物[9]。這研究體現了蛋白組學方法的特異性和選擇性的優點。古淑青等采用超高效液相色譜-高分辨質譜（HPLC-QE）和超高效液相色譜-三重四極桿質譜（HPLC-MS/MS）相結合的方法進行特征肽段的檢測，再通過比對分析篩選出4 種肉類的20 個特征性多肽段，進行驗證和多反應監測（MRM）定量研究，建立了羊肉摻假鑒別的定量測定方法[10]。張穎穎等首先采用高分辨質譜儀（nLC-QE）分別找出牛肉、豬肉和雞肉的相對專屬性多肽鏈，進一步利用液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）的多反應監測模式（MRM）對摻雜豬肉或雞肉的牛肉進行檢測，可以快速進行鑒別并準確定量分析[11]。李瑩瑩等利用蛋白組學的方法研究了5 種常見的食用肉中相對種屬特征性多肽，采用LC-MS/MS 技術對羊肉和鴨肉混合物種特征性的多肽進行了驗證和定量分析，可準確的區分不同的肉種類[12]。Sentandreu 等通過液相色譜-串聯質譜檢測樣品物種特異性肽段或氨基酸，建立了一種檢測肉制品中是否摻入雞肉成分的方法[13]。金紹明等應用非標記蛋白準確定量的方法，通過四極桿串聯飛行時間高分辨質譜分析每種肉類樣品的特異性肽段，進而準確分析摻假肉類的種類[14]。色譜和質譜是基于動物肌肉蛋白的特征性肽段來鑒別肉類品種的，而蛋白質在加工過程中容易發生變性從而增加檢測難度。

2 以免疫學為基礎的檢測方法

常見的以免疫學為基礎的檢測方法有基于抗原-抗體特異性識別的酶聯免疫法、膠體金免疫層析法等方法，具有快速、簡便、特異性好、靈敏度高和低成本的特性。肉類摻假常見的檢測方法是ELISA 技術的間接法和雙抗體夾心法，其原理是通過對樣品中的特異性抗原進行定性或定量識別從而鑒別不同物種的肉類[15-16]。

Liu 等建立了以單克隆抗體為基礎的酶聯免疫吸附試驗，該方法使用一對可以特異性識別骨骼肌肌鈣蛋白I (TnI)的單克隆抗體(MAbs 8F10 和5H9)對樣品進行檢測，可以測定生鮮肉、加工肉以及飼料中豬肉成分的含量，為檢測肉制品和飼料制品中微量豬肌肉組織的污染提供了一種快速、可靠的方法，保證了產品的質量和安全[17]。Rittenbur 等建立了一種間接酶聯免疫吸附法，該方法可以快速、靈敏地測定肉制品中大豆蛋白的含量[18]。免疫技術操作簡便、靈敏性高，但對沒有特異性抗體的樣品不能進行分析，且品種接近的蛋白之間可能會發生交叉反應，掩蓋品種特異性的條帶，因此可能會產生假陽性結果[19]。

3 分子生物學檢測方法

與基于蛋白質的方法相比，基于DNA 的檢測方法通常被認為更靈敏、可靠，因為DNA 在高溫下相對穩定，并且存在于大多數細胞中，而大多數蛋白質在加工過程中失去了它們的生物活性[20-21]。近年來，以分子生物學為基礎的檢驗方法高速發展起來，各種動物源性成分的檢驗檢測技術相繼涌現，如聚合酶鏈式反應技術、實時熒光定量PCR 技術、多重PCR 技術、核酸印跡法、環介導等溫擴增技術、限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應、基于分子雜交的基因芯片技術、微滴數字PCR 方法和DNA條形碼技術[22]。

3.1 實時熒光定量PCR 技術

現行的動物源性成分檢驗標準中，較為多見的是實時熒光定量PCR 方法，該技術在擴增體系中引入熒光集團，通過熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，該方法與傳統PCR 方法相比更加靈敏、準確以及便捷[24]。趙新等以線粒體中細胞色素b 的DNA 序列為目的基因，通過標準曲線的建立、反應方法優化等建立了肉制品中羊源性成分的實時熒光PCR鑒別方法[25]。Xu 等建立了一種多重TaqMan 實時核酸聚合酶鏈反應檢測方法，可同時檢測鴨肉、豬肉、牛肉和雞肉四種源性成分[26]。

3.2 微滴數字PCR 技術

微滴數字PCR 技術是一種新興的核酸定量檢測方法，通過微滴生成儀把反應體系均分到大量反應單元中獨立地進行PCR，并根據泊松分布和陽性比例來計算DNA 初始濃度，與傳統PCR、定量PCR相比，其結果的精確度、準確性和靈敏度更佳[27]。

李偉琦等建立了一種適用于微滴式數字PCR(ddPCR)和芯片式數字PCR(cdPCR)平臺的火雞成分定性定量檢測方法，探索了火雞肉質量與DNA 濃度、DNA 濃度與拷貝數濃度之間的關系，且分別確定了ddPCR 與cdPCR 平臺的檢測限[28]。史艷宇等建立了一種肉制品中鴨源性成分的微滴數字PCR 檢測方法，可以有效測定鴨源性成分且抗干擾性強，靈敏度高[29]。Cai 等以微滴式數字PCR 技術為基礎，研究發現生肉重量與DNA 重量、DNA 重量與DNA拷貝數都呈線性關系，建立了基于DNA 拷貝數計算生肉重量的公式，從而對肉制品中豬肉和雞肉進行準確定量[30]。王珊等通過微滴式數字PCR 方法對樣品中的羊源性和豬源性成分的含量比例進行了準確定量，該方法對判斷樣品中其他種類的動物源性成分是故意添加還是無意沾染提供了技術支持[31]。Wang 等應用微滴式數字PCR 技術建立了肉制品中山羊和綿羊的檢測方法，并確定了檢出限和定量限分別為1 和5 copies/μL，通過用已知比例的混合樣品和市售產品驗證了該方法的準確性，結果表明ddPCR 方法在山羊和綿羊源性定性及定量檢測方面具有較高的精確性和實用性[32]。微滴式數字PCR技術能對模板濃度進行精準定量，但其成本較高，難以大面積推廣應用。

3.3 基因條形碼技術

基因條形碼技術指用某物種特異性的小片段DNA 序列來代表該物種，就像超市利用條形碼掃描區分不同的商品一樣，通過分析這段DNA 序列從而實現快速、準確和自動化的物種鑒別。因動物線粒體細胞色素C 氧化酶亞基基因具有物種特異性的單核苷酸位點，且在深加工的肉制品中保存較為完整，故通常選擇其作為條形碼基因。邱德義等提取了16 份魚類及其制品的基因組DNA，利用動物細胞色素C 氧化酶I（COI）基因的通用引物進行PCR 擴增，擴增產物測序后，通過Genbank 數據庫、DNA 條形碼數據庫對其序列進行比對分析鑒定，快速鑒別魚肉等水產制品的動物源性成分[33]。李新光運用DNA 條形碼技術、PCR-RFLP 和熒光定量PCR 等技術建立了常見魚類成分鑒別技術體系，為魚肉及其制品的真偽鑒別提供技術支持[34]。王爽等以牛、羊、豬、鴨4 種動物的基因組DNA 為模板，以COI 基因為靶基因序列，通過13 對引物進行PCR擴增、測序從中篩選出最優序列，從而建立了4 種動物源性食品的DNA 條形碼鑒別技術[35]。Hellberg等通過對60 種肉類和家禽產品的細胞色素C 氧化酶亞基I(COI)基因進行全長條形碼(658bp)和迷你條形碼(127bp)編碼，將得到的序列與生物條碼數據庫(BOLD)和基因庫進行比對，結果發現全條形碼的測序成功率(68.3%) 高于微型條形碼的測序成功率(38.3%)，為深加工肉類產品的動物源性檢測提供技術參考[36]。雖然DNA 條形碼技術操作簡單，但也存在一定的局限性，如DNA 條形碼數據庫亟待完善、不太適用于多組分肉類制品的檢測等。

近年來，肉類摻假事件屢有報道，相應的可追溯性問題越來越受到重視，因此，開發高效、快速、低成本的檢測方法來識別肉類樣品中的動物源性成分來源迫在眉睫。