太子參多糖-葛根淫羊藿總黃酮對小鼠腦神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)作用的比較＊

余 煊，王欣佩，雷 帆，邢東明，王玉剛，袁梽漪，杜力軍

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100084）

以葛根淫羊藿總黃酮和太子參總多糖為組成的有效部位是我室研究的抗抑郁新藥。目前己完成臨床III期實驗。藥效學(xué)研究表明，該復(fù)合物具有較好的抗實驗動物抑郁樣行為的作用。但是其所涉及的作用機理尚未完全清楚，有待于深入的研究。己有的研究表明，淫羊藿具有多方面的藥理活性，例如神經(jīng)保護、心血管保護、抗癌、抗炎、免疫保護等[1]。其中主要活性成分淫羊藿苷表現(xiàn)出了很好的神經(jīng)保護功能，并且能夠治療和預(yù)防神經(jīng)退行性疾病[2]。葛根總黃酮具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，改善認知，防治卒中后抑郁的作用[3-6]，其主要活性成分葛根素被廣泛用于治療心血管疾病、腦血管疾病、癌癥、帕金森、老年癡呆癥和糖尿病及糖尿病并發(fā)癥等疾病[7,8]。太子參多糖具有抗氧化抗疲勞作用[9,10]，并能夠作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有改善認知，調(diào)節(jié)抑郁樣行為等作用[11,12]。提示三藥對于心腦血管及其神經(jīng)系統(tǒng)具有潛在的調(diào)控作用。

為了全面的揭示該藥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用靶點、復(fù)合物中總黃酮與總多糖各自的作用特點及其與復(fù)合物作用的相關(guān)度，我們進行了小鼠腦神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)實驗研究，以其全面揭示其可能的作用靶點及其特點，并對于太子參總多糖及其葛根淫羊藿總黃酮各自的蛋白作用靶點、以及與合用后對蛋白靶點的差異性進行分析比較和探討。

首先將制備的樣品通過凝膠電泳分離，用不同的化學(xué)試劑對不同的樣品進行區(qū)分標記，混合后通過高壓液相質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）進行蛋白質(zhì)鑒定和分析，從而比對各組樣品間不同蛋白質(zhì)表達情況。并基于相關(guān)數(shù)據(jù)庫對相關(guān)作用蛋白進行功能及其網(wǎng)絡(luò)互作的分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

雄性ICR 小鼠，體重18-22 g。購自北京維通利華實驗動物公司。動物合格證號：京動字SCXH2018-0001。飼養(yǎng)于清華大學(xué)實驗動物中心。太子參，葛根，淫羊藿均購自同仁堂藥材公司，經(jīng)我室向蘭教授鑒定為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla（Miq）. Pax ex Pax et Hoffm干燥塊根，豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim的干燥葉。太子參多糖和葛根淫羊藿總黃酮等受試藥物均由我室植化組提供。其中太子參多糖（簡稱總多糖）的分子量24-25 KDa，含量以葡萄糖計為60%[13-14]；葛根淫羊藿總黃酮（簡稱總黃酮）由葛根和淫羊藿藥材按一定比例混合后提取，過大孔樹脂純化所得，其中總黃酮含量以葛根素計為55%。太子參多糖與總黃酮以1∶1混合組成藥物（簡稱混合物）。

1.2 蛋白質(zhì)組測試

蛋白質(zhì)組測試由清華大學(xué)蛋白質(zhì)分析中心進行。測試儀器為Q-Exactive LC-MS-MS。相關(guān)測量參數(shù)：流 動 相 A：100%+0.1%FA；流 動 相 B：80% 乙 腈 +0.08%FA；梯度：0 min-4%B；5 min-4%B；85 min-35%B；95 min-50%B;100 min-95%B；105 min-95%B；110 min-4%B；120 min-4%B；流速：0.3 uL·min-1；run time：120 min；scan range：400-1800；NCE：30；spray voltage：2.3 KV。

1.3 實驗方法

實驗共分4 組，每組5 只。復(fù)合物組、總黃酮組、總多糖組給藥劑量分別為 800 mg·kg-1、400 mg·kg-1、400 mg·kg-（1藥效學(xué)預(yù)試驗結(jié)果表明，復(fù)合物組有效劑量范圍在200-800 mg·kg-1，因此本次實驗復(fù)合物組給藥劑量采用藥效預(yù)試驗的大劑量，由于復(fù)合物由總黃酮和總多糖1∶1 配制，因此總黃酮組和總多糖組給藥劑量均為400 mg·kg-1）。對照組給等體積生理鹽水。按照相應(yīng)分組方式灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)1 周。第7 天，禁食24 h，于最后1次給藥1 h后脫頸椎處死小鼠并取腦后，立刻-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品制備與測試[15]。

稱取新鮮動物組織，加入2%SDS（含PMSF），勻漿后置于冰上。取適量勻漿液低溫（4℃），12000 rpm 離心10 min。取上清用雙縮脲法或蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。將剩余勻漿加入適量蛋白loading buffer，開水煮沸加熱20 min，中間每隔幾分鐘振蕩1 次使蛋白充分變性，-20℃保存。

根據(jù)測得的蛋白濃度調(diào)整上樣量，使上樣樣品總蛋白量保持一致。用10%SDS-PAGE 膠分離蛋白，考馬斯亮藍染色后送清華大學(xué)蛋白化學(xué)平臺檢測。所測結(jié)果導(dǎo)入相關(guān)數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析。

所測試蛋白有效數(shù)據(jù)納入標準：Score ＞5，Count ＞ 2，Variability ＜ 50%。與對照組比值 ≤ 0.7 定為蛋白表達下調(diào)，與對照組比值≥1.3 定為蛋白表達上調(diào)。測試結(jié)果經(jīng)LC/MS OBITRACK 數(shù)據(jù)工作站分析。DAVID Bioinformatics Resources 數(shù)據(jù)庫（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）進行 Clustering 功能及其 KEGG信號通路分析。STRING:Functional Protein Association Networks（String）（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫進行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 總體分析

本次共測試5567 個蛋白。本次實驗黃酮多糖復(fù)合物組（簡稱復(fù)合物）有效數(shù)據(jù)4209個蛋白，總黃酮組3779個蛋白，總多糖組4115個蛋白數(shù)據(jù)。復(fù)合組下調(diào)蛋白28 個，占0.66%，上調(diào)蛋白124 個，占2.95%。黃酮組下調(diào)蛋白169 個，占4.47%，上調(diào)蛋白869 個，占22.99%。多糖組下調(diào)蛋白10 個，占0.24%，上調(diào)蛋白370 個，占8.99%（圖1）。多糖部分上調(diào)蛋白明顯大于下調(diào)蛋白。黃酮部分的下調(diào)蛋白與下調(diào)蛋白的比例與復(fù)合物基本相同。多糖部分則明顯上調(diào)蛋白多于下調(diào)蛋白（圖1D）。根據(jù)KEGG pathway（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）分析可見，復(fù)合物組上調(diào)蛋白主要涉及cAMP signaling, Calcium signaling, HIF-1 signaling,adrenergic signaling, dopanergic signaling, neurotrophin signaling, Wnt signaling, cholinergic synapse, 長時程電位等與細胞代謝、氧化磷酸化及其神經(jīng)相關(guān)信號通路或生理功能。復(fù)合物組下調(diào)蛋白主要涉及到酮體代謝 、p53 signaling、MAPK signaling, Ras signaling,chemoking signaling 等。總黃酮部分上調(diào)蛋白主要涉及線粒體、氧化磷酸化、NADP 等。下調(diào)蛋白主要涉及到線粒體、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體自噬、MAPK signaling, NFκB signaling, NOD-like receptor singaling,TNFα signaling 等。總多糖組上調(diào)蛋白主要涉及核小體、線粒體、神經(jīng)突觸、氧化還原、細胞間粘附（cellcell adhesion）等。下調(diào)蛋白主要涉及自噬調(diào)節(jié)和GABA能神經(jīng)元突觸。

圖1 總黃酮、總多糖及其復(fù)合物對小鼠腦蛋白表達影響的概況

2.2 復(fù)合物、總黃酮和總多糖上調(diào)蛋白的功能及其作用于線粒體基因分析

由上表明，復(fù)合物及其黃酮與多糖總體以上調(diào)蛋白為主。為此我們主要對上調(diào)蛋白進一步進行分析。圖2A 所示復(fù)合物、總黃酮和總多糖上調(diào)蛋白的功能分析。三組都主要作用于核糖體核蛋白，轉(zhuǎn)錄翻譯，轉(zhuǎn)運等。其中三組蛋白數(shù)最多的均為線粒體。可見線粒體是三組的主要作用位點。進一步對三組線粒體蛋白比對分析可見，總黃酮組蛋白為208個，其次為總多糖組61 個，復(fù)合物組則為22 個。其中總黃酮與復(fù)合物相同的有7 個，總多糖與復(fù)合物相同的4 個，總多糖與總黃酮相同的31 個，三組都有的共8 個（圖2B）。可見總黃酮與總多糖上調(diào)的蛋白多數(shù)在合用時都沒有產(chǎn)生作用。

對作用于線粒體的蛋白進一步分析可見，3組有8個蛋白均作用于線粒體，涉及到線粒體氧化呼吸和能量代謝，以及膜穩(wěn)定性等方面，并且還存在有一定的蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（圖2C）。其中HMGCS2（3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 2，Hmgcs2）是線粒體羥甲基戊二酰輔酶A 合酶，該酶將乙酰輔酶A 與乙酰乙酰輔酶A 縮合形成HMG-CoA，為HMG-CoA 還原酶的底物。主要與線粒體內(nèi)膜及其基質(zhì)構(gòu)建，以及其脂質(zhì)合成與代謝有關(guān)。在腦神經(jīng)元能量代謝中起著重要的作用[16]。OXSM（3-oxoacyl-ACP synthase，mitochondrial，Oxsm）為線粒體3-氧代酰基-[酰基載體蛋白]合酶。主要與線粒體所需脂肪酸合成，以及三酸循環(huán)，細胞質(zhì)等有關(guān)，屬于β-酮酰基-ACP 合 酶 家 族[17]。 IDH2（isocitrate dehydrogenase 2(NADP+)，mitochondrial，Idh2）為線粒體異檸檬酸脫氫酶[NADP]。在線粒體中間代謝和能量產(chǎn)生中起作用，它可能與丙酮酸脫氫酶復(fù)合物緊密結(jié)合或相互作用。主要參與線粒體膜穩(wěn)定及其氧化還原反應(yīng)，糖氧化循環(huán)，三羧酸循環(huán)，NADP 生成與代謝，負性調(diào)控膠質(zhì)細胞增殖與遷移等有關(guān)。屬于異檸檬酸和蘋果酸異丙酯脫氫酶家族[18]。MSRB2（methionine sulfoxide reductase B2，Msrb2）為線粒體蛋氨酸-R-亞砜還原酶B2。在氧化應(yīng)激時，通過其清除作用而減少細胞內(nèi)活性氧的積累，在維持線粒體完整性中發(fā)揮作用，從而有助于細胞存活和蛋白質(zhì)修復(fù)。主要涉及線粒體氧化還原反應(yīng)，對氧應(yīng)激性應(yīng)答，蛋白修復(fù)等，并與線粒體自噬有關(guān)[19]。 MRPS27（mitochondrial ribosomal protein S27，Mrps27)是線粒體28S 核糖體蛋白S27。線粒體小核糖體亞基（mt-SSU）的RNA 結(jié)合成分，在線粒體蛋白質(zhì)合成中起作用。刺激線粒體電子傳輸鏈亞基成分的線粒體mRNA 翻譯，與線粒體12S rRNA（12S mtrRNA）和tRNA結(jié)合，也參與細胞增殖和腫瘤細胞生長的調(diào)控。主要涉及線粒體，核糖體以及細胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物等[20]。MTRF1L（mitochondrial translational release factor 1-like，Mtrf1l)為線粒體肽鏈釋放因子，可響應(yīng)肽鏈終止密碼UAA和UAG，指導(dǎo)翻譯終止。主要涉及終止線粒體翻譯相關(guān)因子釋放，核糖體生成等。PDK1（pyruvate dehydrogenase kinase, isoenzyme 1，Pdk1)是線粒體[丙酮酸脫氫酶（乙酰轉(zhuǎn)移）]激酶同工酶1。激酶通過丙酮酸脫氫酶亞基PDHA1 和PDHA2 的磷酸化在葡萄糖，脂肪酸代謝和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。因其抑制丙酮酸脫氫酶的活性，從而調(diào)節(jié)通過三羧酸循環(huán)的代謝物通量，下調(diào)有氧呼吸并抑制丙酮酸形成乙酰輔酶A。在細胞對缺氧的反應(yīng)中起重要作用，并且對于缺氧下的細胞增殖也很重要。主要涉及調(diào)控乙酰輔酶A 合成，碳水化合物代謝過程，糖代謝過程，蛋白質(zhì)氧化磷酸化，以及細胞膜受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞增殖，氧應(yīng)激所啟動的固有凋亡信號通路，HIF1α 信號通路，線粒體去極化反應(yīng)所致線粒體自噬等[21]。SLC25a24(solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier),member 24，Slc25a24)是鈣結(jié)合線粒體載體蛋白SCaMC-1，鈣依賴性線粒體溶質(zhì)載體。介導(dǎo)Mg-ATP或Mg-ADP 與磷酸根離子可逆的電中性交換，催化線粒體內(nèi)膜上腺嘌呤核苷酸的吸收或流出。當(dāng)胞質(zhì)鈣水平低時，核苷酸轉(zhuǎn)運是無活性的，并且通過胞質(zhì)鈣水平的增加而被激活。還能通過促進線粒體中磷酸鈣沉淀物的形成來保護細胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞死亡。主要涉及線粒體鈣通道，線粒體膜穩(wěn)定，從而影響多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[22]。由此可見3 組共同上調(diào)的8 個蛋白主要作用于線粒體并涉及到線粒體多方面功能，提示其可能是該藥作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要的基礎(chǔ)。

圖2 復(fù)合物、總黃酮和總多糖上調(diào)蛋白表達及其作用于線粒體基因分析

2.3 復(fù)合物組蛋白調(diào)控及其與黃酮組和多糖組的對應(yīng)關(guān)系

圖3 復(fù)合物下調(diào)蛋白及其與總黃酮和總多糖相關(guān)性分析。

進一步分析可以發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物組上調(diào)蛋白明顯低于總黃酮組和總多糖組，而下調(diào)蛋白明顯低于總黃酮組，表明黃酮多糖合用后對于蛋白的表達起到了復(fù)合的效應(yīng)。為此，我們以復(fù)合物組為基準，對于其中上調(diào)或下調(diào)蛋白對應(yīng)的總黃酮和總多糖組相應(yīng)數(shù)據(jù)進行分析，以深入探討復(fù)合物對腦神經(jīng)蛋白表達的具體作用。

2.3.1 復(fù)合物組下調(diào)蛋白及其與黃酮組和多糖組對應(yīng)關(guān)系

在與總黃酮組與總多糖組相對應(yīng)蛋白分析中，復(fù)合物組共有28 個蛋白下調(diào)（圖3A）。其中有3 個在總黃酮組卻明顯上調(diào)（與對照組相比≥1.3），表明復(fù)合物組的這3個蛋白的下調(diào)由總多糖組所貢獻。總黃酮上調(diào)的 3 個蛋白分別是 PRPS2,E9QLT0，QCR10，對應(yīng)基因分別為Prps2，Hyi，Uqcr11（圖 3B-D）。根據(jù) String protein network 分析表明三蛋白之間沒有相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（圖3E）。其中PRPS2 為磷酸核糖焦磷酸合成酶（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2，Prps2)，主要與嘌呤代謝，碳代謝以及氨基酸合成等有關(guān)[23]。E9QLT0 基 因 名 稱 為Hyi（hydroxypyruvate isomerase，Hyi)，主要涉及乙醛酸和二羧酸酯代謝等[24]。QCR10為泛醇-細胞色素c 還原酶復(fù)合物III 亞基XI（ubiquinol-cytochrome c reductase, complex III subunit XI，Uqcr11），主要涉及線粒體及其線粒體呼吸鏈，氧化磷酸化等生理功能，并與參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)精神病癥，如阿爾茨海默氏病（Alzheimer's disease），帕金森氏病（Parkinson's disease），享廷頓氏病（Huntington's disease），抑郁癥等[25]。

三組蛋白表達均明顯下調(diào)（與對照組相比≤0.7）的 共 有 6 個 蛋 白 ，分 別 為 ACTC，K2C6A，K1C17，K1C42，Q6IFZ8，CE290。對應(yīng)的基因分別為Actc1，Krt6a，Krt17，Krt42，Gm5414，Cep290。主要涉及心肌收縮（Cardiac muscle contraction），心肌腎上腺素能信號（Adrenergic signaling in cardiomyocytes），肥厚性心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy），心肌擴張（Dilated cardiomyopathy）等相關(guān)信號通路。根據(jù)String protein network 分析可見，其Gm5414，Krt6a，Krt17有蛋白互作關(guān)系（圖3F）。

圖4 復(fù)合物上調(diào)蛋白及其與總黃酮和總多糖相關(guān)性分析。

2.3.2 復(fù)合物組上調(diào)蛋白及其與黃酮組和多糖組對應(yīng)關(guān)系

復(fù)合物組上調(diào)蛋白共36 個，其中25 個蛋白為三組均一致上調(diào)。復(fù)合物組中有4個蛋白上調(diào)，但黃酮、多糖兩組均下調(diào)，分別是PGK2，RTN4，SEC13，SPCS，其基因名分別為Pgk2，Rtn4，Sce13，Sepsecs。復(fù)合物組、總黃酮組均上調(diào)，但是總多糖下調(diào)的有4 個，分別是 ARF3，SMAP2，MGST3，RUXE，其基因名分別為Arf3,Smap2,Mgst3,Snrpe。這4 個蛋白的上調(diào)主要由總黃酮組貢獻。復(fù)合物組、總多糖組均上調(diào)，總黃酮組下調(diào)的有3 個，其蛋白名稱分別為ERP44，HPT，TBCEL，其基因名分別為Erp44,Hp,Tbcel。復(fù)合物組的此3個蛋白上調(diào)主要由總多糖組貢獻（圖4）。

25 個上調(diào)的蛋白主要涉及色氨酸代謝，乙醇代謝，腺嘌呤代謝，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，以及三羧酸循環(huán)等代謝。同時涉及到線粒體，細胞質(zhì)，ATP-binding, Nucleotide-binding 等多種生理功能。String 分析，其中部分蛋白之間有相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（圖4A&B）。

在復(fù)合物組上調(diào)但總黃酮和總多糖均下調(diào)的4個蛋白，主要涉及單碳代謝，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工（Protein processing in endoplasmic reticulum），RNA 轉(zhuǎn)運（RNA transport），氨酰基-tRNA 生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis,），氨 基 酸 合 成（Biosynthesis of amino acids），糖酵解/糖異生（Glycolysis/Gluconeogenesis）等。而這些活性都可以影響到神經(jīng)元及其神經(jīng)突觸的生理功能。String分析表明，這4個蛋白之間沒有明顯的相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

復(fù)合物組上調(diào)蛋白中有3 個為總多糖所貢獻：ERP44，HPT，TBCEL；有4 個為總黃酮所貢獻：ARF3，SMAP2，MGST3，RUXE（圖 4C）。其中總多糖ERP44（endoplasmic reticulum protein 44）主要涉及到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，蛋白質(zhì)折疊，糖蛋白代謝和細胞氧化還原穩(wěn)定性等生理功能[26]。HPT（haptoglobin）主要與急性應(yīng)激反應(yīng)，免疫，肝臟發(fā)育等有關(guān)，同時還涉及Notch 信號通路[27]。TBCEL（tubulin folding cofactor E-like）主要與蛋白質(zhì)和蛋白骨架有關(guān)，同時還涉及到蛋白裂解，蛋白磷酸化，富含亮氨酸重復(fù)區(qū)域識別，蛋白質(zhì)組鑒別等[28]。

其中總黃酮貢獻的4 個蛋白：ARF3 為ADP 核酶輔助因子（ADP-ribosylation factor 3），主要與蛋白、囊泡轉(zhuǎn)運，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，小GDP 酶介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，GDP 結(jié)合等有關(guān)[29]。SMAP2（Stromal membrane-associated protein 2）主要作用于ARF1 的GTPase 活化蛋白，也可以激活A(yù)RF6，可能在網(wǎng)格蛋白依賴的從早期內(nèi)涵體（endosome）到反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)（trans-Golgi network）的 逆 行 轉(zhuǎn) 運 中 起 作 用[30]。 MGST3（microsomal glutathione S-transferase 3）主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞外泌體等有關(guān)[31]。RUXE (small nuclear ribonucleoprotein E)主要涉及mRNA 剪接，在維持神經(jīng)元相關(guān)蛋白因子正常翻譯修飾中起一定的作用[32]。

3 總結(jié)

本研究首次從蛋白質(zhì)組學(xué)角度觀察了太子參總多糖，葛根淫羊藿總黃酮對腦神經(jīng)細胞相關(guān)蛋白表達的調(diào)控作用。兩者均顯示其對線粒體多位點的作用是其作用特點，其中線粒體氧化磷酸化，膜穩(wěn)定，三羧酸循環(huán)等是其作用的具體位點。提示其可能作用于神經(jīng)元并影響能量代謝的潛在的機制。另外，本研究首次發(fā)現(xiàn)，藥物組合應(yīng)用可以使蛋白表達低于各組成部分的蛋白表達。總黃酮、總多糖及其二者復(fù)合物對于腦神經(jīng)調(diào)控的蛋白數(shù)量不完全相同，單獨應(yīng)用時其上調(diào)蛋白明顯多于復(fù)合物，提示藥物復(fù)合物使得一些蛋白調(diào)控作用發(fā)生了變化，使其作用蛋白更具體更明確，體現(xiàn)了體內(nèi)作用的復(fù)雜性，同時也提示藥物復(fù)合作用并非僅僅是各組成部分的簡單相加，即使在蛋白表達上也是如此。本工作為進一步探討太子參、葛根、淫羊藿在調(diào)控神精精神方面的分子作用提供了重要的實驗依據(jù)。當(dāng)然，作為1種篩選式的實驗研究，雖然蛋白質(zhì)組學(xué)提供了許多新的靶點及相關(guān)信息，但這只是機制研究的開始，尚有待于在今后的研究工作中通過具體實驗逐一證實。