MOFs包封纖維素酶的制備及性能研究

張學松，楊陳陽，陶娟

（江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌330013）

金屬-有機框架材料(MOFs)是由有機配體與金屬離子或團簇通過配位鍵自組裝而成的一種新型的有機-無機雜化晶態多孔材料，具有高孔隙率、大比表面積、孔徑可調及可裁剪性等優勢，已成為現代化學和材料領域的一大研究熱點。

目前采用MOFs作為纖維素酶載體的文獻報道中，其固定化方法主要以物理吸附法、化學結合法及化學交聯法為主，本研究首次采用原位封裝法，即在MOFs材料制備過程中預先加入纖維素酶，最終酶被包封在MOFs框架內，形成牢固結合的固定化酶，纖維素酶@MOFs。該包封型固定化酶不僅能提高纖維素酶的穩定性，顯著減少由于酶的脫附引起整體酶活性的降低；同時酶的固定不再局限于載體表面，還可被封裝在MOFs框架內，從而極大地提高了酶的負載量。孔徑檢測的結果可進一步驗證纖維素酶在MOFs中的分布。本研究還對纖維素酶@MOFs的穩定性進行了評價。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

RCT型IKA磁力攪拌器(江西鼎技科學儀器有限公司)；TF-FD-1型冷凍干燥機（上海田楓實業有限公司）；UV-5200PC型紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Autosorb IQASIQ型物理吸附儀（美國quantachrome公司）。

纖維素酶、2-甲基咪唑（2-mIm）、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、考馬斯亮藍G-250（分析純，薩恩化學技術（上海）有限公司）；乙酸鋅(Zn(CH3COO)2)（分析純，西隴科學股份有限公司）。

1.2 纖維素酶@ZIF-8的制備

本研究以鋅基MOFs，沸石咪唑框架材料-8(ZIF-8)，作為纖維素酶的固定化載體，制備方法參考文獻Wu等(2019)[1]并略做改動，首先稱取0.6856 g Zn(CH3COO)2溶于300 mL去離子水中得溶液A；稱取0.984 g 2-mIm溶于300 mL去離子水中得溶液B；稱取纖維素酶粉0.20 g溶于25 mL緩沖溶液（pH 4.8,0.1 M）中得溶液C。將上述溶液A,C逐滴加至溶液B中，室溫下攪拌反應12h，過濾，去離子水洗滌三次，除去未反應的分子。產品在真空條件下冷凍干燥24 h，制得纖維素酶@ZIF-8。

1.3 纖維素酶負載量的測定

采用考馬斯亮藍法[2]通過測定纖維素酶中蛋白質的含量來確定纖維素酶的質量。最終纖維素酶負載量用下式表示：

其中，M0為纖維素酶的初始加入質量，mg；M1為未被固定的纖維素酶的質量，即反應上清液中游離纖維素酶的質量，mg；M為載體ZIF-8的質量，g。

1.4 纖維素酶@ZIF-8的活性評價

采用羧甲基纖維素法測定纖維素酶的活性，首先量取2 mL CMC-Na至反應管中，加0.5 mL纖維素酶液混勻，40℃下搖床反應30 min。之后加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸顯色劑（DNS），沸水浴加熱5 min滅活，冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，540nm測光密度值。本研究以40℃、pH4.5最適反應條件下，纖維素酶的活性作為計算標準，纖維素酶@ZIF-8的酶活性均以相對活性表示。

1.5 纖維素酶@ZIF-8的孔徑測定

纖維素酶@ZIF-8的孔徑分布采用美國Quantachrome公司生產的Quantachrome Autosorb-IQASIQ物理吸附儀進行表征，由非局域密度泛函理論（NLDFT）計算得到，并在77K條件下測定了氮氣吸附脫附等溫線。樣品在進行氮氣物理吸附前在200℃脫氣10 h。

2 結果與討論

2.1 纖維素酶@ZIF-8中酶的負載量

本研究在ZIF-8的制備過程中添加了不同比例的纖維素酶進行原位封裝，結果顯示，隨著初始纖維素酶加入量的增加，纖維素酶@ZIF-8中酶的負載量也隨之增加，當纖維素酶的加入量為ZIF-8質量的50%時，酶的負載量達到最高值為350mg/g。相比吸附法或交聯法制備的固定化纖維素酶[3]，原位封裝法可獲得較高的酶負載量，這是由于纖維素酶的固定不再局限于MOFs載體的表面，還可被封裝在MOFs框架內，從而極大地提高了酶的負載量，同時固定化酶的比酶活性也隨之提高。

2.2 纖維素酶@ZIF-8的穩定性

本研究對比了纖維素酶與纖維素酶@ZIF-8在pH 3~8反應條件下的相對酶活性，結果如圖1所示。纖維素酶的最佳pH值為4.5，隨著pH值的增大，酶活性迅速下降，當pH為8時，相對酶活性僅為最佳條件時的10%；纖維素酶@ZIF-8的最佳pH值為5，并在pH5~8的環境下保持較高的酶活性，特別是在pH8反應條件下中，仍能保持65%的相對酶活性。固定后的纖維素酶@ZIF-8表現出更好的堿性耐受性，可能是ZIF-8本身在堿性條件下結構穩定，對纖維素酶蛋白質的構象變化起到了一定保護作用。

圖1纖維素酶與纖維素酶@ZIF-8在不同pH反應條件下的相對酶活性

本研究還對比了纖維素酶與纖維素酶@ZIF-8在不同反應溫度下的相對活性，結果如圖2所示。纖維素酶在40℃時活性最高，隨著溫度升高，活性逐漸降低，當反應溫度為80℃時，相對酶活性為85%。纖維素酶@ZIF-8的最佳反應溫度為50℃，酶活性也隨溫度升高緩慢降低，在80℃反應條件下，相對酶活性為88%。固定后的纖維素酶@ZIF-8最佳反應溫度比固定前提高了10℃，可能是ZIF-8對纖維素酶的包封，限制了纖維素酶的蛋白質在加熱過程中的遷移率和構象的變化，所以，纖維素酶@ZIF-8的溫度耐受性隨之提高。

圖2 纖維素酶與纖維素酶@ZIF-8在不同反應溫度下的相對酶活性

2.3 纖維素酶@ZIF-8的孔徑分布

圖3 纖維素酶@ZIF-8的孔徑分布圖

圖4 纖維素酶@ZIF-8的N2吸附-脫附等溫線

從圖3孔徑分布圖中可以看出：纖維素酶@ZIF-8的孔徑均為大于2 nm的介孔結構。圖4為氮氣吸附-脫附等溫線，在中壓（0.3~0.8）范圍內，吸附曲線緩慢上升，并且存在一個后滯環，同樣說明介孔結構的存在。由于ZIF-8本身的孔徑分布在0.34~1.1 nm[4]之間，屬于典型的微孔MOFs，纖維素酶的引入，導致ZIF-8在組裝過程中形成了缺陷，從而使得孔徑變大得到介孔結構，由此進一步證明了纖維素酶被有效地封裝在了ZIF-8的框架內，制得包封型固定化酶。

3 結論

采用原位封裝法在ZIF-8的制備過程中引入纖維素酶，最終酶被包封在ZIF-8的框架內，得到纖維素酶@ZIF-8，該固定化酶具有結合牢固、負載量高、對堿耐受性良好等優點。同時纖維素酶的引入導致ZIF-8的微孔結構產生缺陷進而形成介孔結構，更加有利于底物和產物的自由擴散，為后續纖維素的酶催化反應提供廣闊的應用前景。