柳樹種質核DNA含量的流式測定

何旭東，鄭紀偉，王 宇，教忠意，諸葛強

(1. 江蘇省林業科學研究院，江蘇 南京 211153； 2. 江蘇省農業種質資源保護與利用平臺柳樹資源圃，江蘇 南京 211153;3. 南京林業大學，江蘇 南京 210037)

基因組大小是生物最基本的特征之一，通常用未復制的單倍體或配子細胞核DNA的總含量來估算，即C值(C-value)，一般用皮克(10-12g)表示[1]。DNA含量C值的研究意義重大，特別是在細胞生物學、發育生物學、進化生物學、分子生物學、分類學、生理學與古生物學等研究領域[2-4]。近年來，大量的研究發現，C值還與種子質量、光合速率、葉細胞大小、氣孔密度、基因組進化模式等存在一定的相關性[5]。Bennett等[6]建立了植物C值數據庫(https:∥cvalues.science.kew.org)，截止目前共收錄了12 273 個物種核DNA含量的C值信息，包括被子植物類、裸子植物類、蕨類、苔蘚類和藻類。不同植物間C值差異較大，已知幾種藻類如紅藻(Galdieriasulphuraria)、微藻(Ostreococcustauri)、類藍藻(Cyanidiumcaldarium)的C值最小，只有0.01 pg，最大的為日本重樓(Parisjaponica)，C值達到152.23 pg。

柳樹屬楊柳科(Salicaceae)，通常指鉆天柳屬(Chosenia)和柳屬(Salix)包含的所有樹種。全世界柳樹有500種以上，而中國是柳樹的分布中心，據中國植物志記載，我國有柳樹257種，其中2/3為灌木柳。自古以來，柳樹是我國重要的園林綠化樹種，也是不可或缺的防護及用材樹種[7]。在北美及歐洲，柳樹還被廣泛用于生物質能源[8]。柳樹生長迅速、繁殖容易、基因組大小適中，是木本植物開展遺傳學與基因組學研究的理想模式樹種[9]。由于柳樹種類繁多、變異豐富、種間及種內雜交極為容易，導致其系統分類極為復雜，迄今為止國內外學者仍有較大爭議。根據植物C值數據庫查詢，目前國外僅有15份(14個種)的柳樹C值檢測結果，占柳樹總數量的3%不到，而國內尚未見相關報道(見表1)。鑒于此，本研究利用流式細胞儀檢測22份柳樹不同種質的核DNA含量，并估算其基因組大小，旨在為柳樹系統分類、細胞生物學及基因組學的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與標樣

本研究試驗材料包含柳樹14個自然種和8個品種，共計22份種質材料，其中喬木柳10份，灌木柳12份(見表2)。所有植株均定植于江蘇省林業科學研究院柳樹種質資源圃內。采集各植株幼嫩葉片備用。大豆(Glycinemax，1C=1.13 pg)由南京農業大學惠贈，在本試驗中作為灌木柳樣品的內標；水稻日本晴(Oryzasativasubsp.Japonica‘Nipponbare’, 1C = 0.397 5 pg)由江蘇省農業科學院惠贈，在本試驗中作為喬木柳樣品的內標。

1.2 試驗方法

1.2.1 解離液與熒光染料 選用LB01為解離液，具體配方為：15 mmol/L Tris, 2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L 四鹽酸精胺，20 mmol/L NaCl，80 mmol/L KCl，0.1%(V/V)TritonX-100，pH值為7.0—8.0；選用終濃度為50 μg/mL的碘化丙啶(PI)為熒光染料。均于冰箱4 ℃保存備用。

表1 已發表的柳樹不同個體核DNA含量(1C值)

1.2.2 細胞核懸液制備與染色 各取1 g左右待測樣品及內標材料幼嫩葉片置于培養皿中，加入1 mL LB01解離液，用刀片快速切碎葉片。吸取上清液于400目濾網過濾，置于冰上孵育5 min，4 ℃，1 000 r/min離心5 min。吸取上清并加入10 μg/mL的RNase，隨后加入0.5 μL PI熒光染料，混勻后置于冰上避光孵育20 min上機檢測。

1.2.3 上機檢測 流式細胞儀為美國BD公司的Influx系統，熒光激發波長為488 nm，低速檢測，每次收集顆粒10 000個。先分別以大豆和水稻單獨上機檢測，記錄相對熒光強度范圍。每個樣品重復檢測3次。變異系數(CV)控制在5%以內。

1.3 數據分析

利用流式細胞儀自帶軟件FACSTM Software進行數據采集及分析。待測樣品核DNA含量(1C值)計算表達式為(待測樣本G0/G1峰熒光強度 / 標樣G0/G1峰熒光強度)×標樣細胞核DNA含量(1C值)[5]。DNA含量與基因組大小換算表達式為1 pg DNA=978 M bp[15]。利用SPSS軟件進行統計與方差分析。

2 結果與分析

2.1 標樣熒光范圍的確定

為減小試驗誤差，本研究采用待測樣品與內標混合測定的方法進行檢測。混合檢測前，單獨對內標進行上樣檢測。結果表明：水稻‘日本晴’的熒光強度在10 000附近，大豆熒光強度在22 000附近。經查詢，已發表的灌木柳自然種基因組C值為0.4 pg左右，喬木柳自然種基因組C值為0.8 pg左右(見表1)。由于核DNA含量與熒光強度成正比，為使待測樣品與內標熒光強度峰值能有效區分，因此選擇水稻為喬木柳待測樣品內標，且樣品峰位于內標峰的右側；選擇大豆為灌木柳待測樣品內標，且樣品峰位于內標峰的左側。

2.2 基因組C值的測定

分別將22個柳樹待測樣品與內標混合上機，檢測結果如圖1，2所示，樣品峰與內標峰清晰且無重疊，區分度較好，表明本試驗結果可靠。經系統自帶軟件收集數據并經統計分析后，得到22個個體的核DNA含量與基因組大小值(見表3)。

圖1 部分喬木柳種質與內標水稻‘日本晴’混合上樣檢測結果

圖2 部分灌木柳種質與內標大豆混合上樣檢測結果

表2 試驗材料

按自然種與品種不同類型分析，自然種中，龍爪柳核DNA含量1C值最大，為0.67 pg，基因組大小為660 M bp；其次為垂柳，核DNA含量1C值為0.60 pg，基因組大小為582 M bp；蒿柳核DNA含量1C值最小，為0.38 pg，基因組大小為369 M bp。品種中，蘇柳932核DNA含量1C值最大，為0.90 pg，基因組大小為876 M bp；其次為蘇柳1011，核DNA含量1C值為0.87 pg，基因組大小為847 M bp；蘇柳1053最小，核DNA含量1C值為0.39 pg，基因組大小為385 M bp。

按喬木柳與灌木柳不同類型分析，喬木柳中，蘇柳932核DNA含量1C值最大，其次為蘇柳1011，粉枝柳核DNA含量1C值最小，為0.43 pg，基因組大小為417 M bp。灌木柳中，灰柳核DNA含量1C值最大，為0.60 pg，基因組大小為588 M bp；其次為歐洲紅皮柳，核DNA含量1C值為0.47 pg，基因組大小為459 M bp；蒿柳核DNA含量1C值最小。

2.3 基因組C值的比較

多重比較分析表明：柳樹大部分個體間核DNA含量1C值存在顯著差異(P<0.05)，部分個體間沒有顯著性差異，如垂柳、灰柳與蘇柳795，細柱柳、銀柳、蘇柳2345、蘇柳52-2與蘇柳9-6(見表3)。進一步將22個個體劃分成喬木柳和灌木柳2個組，方差分析結果表明：喬木柳和灌木柳組間存在極顯著差異(P<0.01，見表4)。

3 結論與討論

早期的研究認為，物種的DNA C值具有特異性，是恒定不變的，但隨著樣本來源的多樣化及檢測量的增加，越來越多的研究表明同一物種的不同個體間DNA C值也存在一定的差異[16]。本研究選取的22個待測樣本中，有5個與C值數據庫中已公布的種相同。其中，蒿柳(0.38 pg)和歐洲紅皮柳(0.47 pg)與數據庫中公布的C值數據差異不大(蒿柳0.41 pg，歐洲紅皮柳0.43 pg)，但垂柳(0.60 pg)、白柳(0.59 pg)和灰柳(0.60 pg)與數據庫中公布的C值數據差異較大(垂柳0.77 pg，白柳0.83 pg，灰柳0.85 pg)。類似的結論在木蘭科[17]及鳶尾屬[18]的研究中也所有發現。推測其原因，最主要的可能是由于林木世代周期長、高度雜合而引起遺傳背景的差異而導致。此外，不同的氣候條件、生態環境、種群大小、發育階段、取樣部位等也可能導致檢測的差異[16,19]。

表3 不同柳樹種質的核DNA含量(1C值)

表4 不同類型柳樹核DNA含量的方差分析

基因組中重復序列的變化和多倍化事件是真核生物基因組進化產生差異的主要原因。楊柳科植物起源于同一個古四倍體祖先，在逐步進化過程中，重新二倍化后形成楊樹和柳樹2大進化分支[20]。相比楊樹，柳樹進化更加完全，由于其獨特的生物學特性而導致基因組不斷的多倍化，形成了從二倍體(2n=38)到十二倍體(2n=228)的完整倍性體系[7]。有研究表明，同一類群中，物種的DNA C值與倍性水平呈正相關，即C值隨著倍性的增加而增大[21]。本研究中，通過表4方差分析可知，喬木和灌木2種類型間核DNA含量存在極顯著差異，且喬木類型要高于灌木類型。在自然界中，通常情況下灌木柳大多為二倍體，如簸箕柳、杞柳歐洲紅皮柳等，而喬木柳大多為多倍體，如垂柳、白柳、旱柳等，多為四倍體[7]。

在喬木類型中，鉆天柳屬于鉆天柳屬，而鉆天柳屬是介于楊屬和柳屬之間的過渡類型。據文獻記載，鉆天柳是二倍體[7]，因此其核DNA含量(0.48 pg)相比較其他喬木柳要小很多。而幾個喬木柳品種如蘇柳172、蘇柳932和蘇柳1011由不同喬木柳雜交而來，屬異源多倍體，其核DNA含量相比較其他喬木柳自然種要大很多。但幾個灌木柳品種如蘇柳2345、蘇柳52-2和蘇柳9-6在雜交后其核DNA含量相比其他灌木柳自然種差異不大。推測其原因，一方面可能是由于本研究中的待測樣本與雜交親本個體本身差異引起，另一方面可能是由于多倍體染色體組配對與重組更為復雜造成的[16]。此外，喬木類型中的粉枝柳(0.43 pg)和灌木類型中的灰柳(0.60 pg)在各自類型中與其他個體數值差異較大，推測可能是由于倍性差異而導致，有待于進一步的核型分型來確認。