基于文獻計量分析的禾本科牧草染色體加倍研究進展

王 晶， 伏兵哲，3*

(1. 寧夏大學農學院， 寧夏 銀川 750021； 2. 寧夏草牧業工程技術研究中心， 寧夏 銀川 750021；3. 寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室， 寧夏 銀川 750021)

多倍體是指擁有2個以上完整染色體組的個體[1]，可以通過自然發生和人工誘導產生。自然發生多倍體是具有不同倍性水平的物種間天然雜交或未減數配子與種間或種內配子結合而形成[2]，其形成相對緩慢且比較罕見，據前人統計被子植物中自然形成的多倍體物種只有2%～4%[3]。隨著植物育種技術的深入研究及多倍體誘導技術的廣泛應用，人們通常利用物理、化學、生物等人工誘導方法以提高多倍體的發生頻率，從而克服在自然界中由于一些植物倍性水平不同而不能進行物種間雜交、雜交后代不育以及某些屬只有一個物種等所導致的植物基因庫狹窄、經濟價值性狀低等問題[4]。多倍體植株一般表現為器官巨大、抗逆性強，但往往也伴隨著生長慢、矮生、育性低等特征[5]，因此多倍體育種技術主要適用于以收獲營養體為主的植物種質創新、改良和品種選育。綜上，人工誘導多倍體技術被認為是促使生物多樣性增加的一個有價值的工具，它增加了種質的多樣性，為育種工作的延續奠定了基礎[6-9]。

禾本科牧草作為家畜生長繁育的重要飼草，在維持我國畜牧業穩定發展以及草原生態系統平衡方面有著不可替代的作用[10]，因而培育出優良牧草品種并使其成功應用于生產實踐有著重大現實意義。多倍體誘導不僅可以提高禾本科牧草的飼用價值，而且促進了生物進化與育種技術的發展。近年來，許多育種家在禾本科牧草多倍體誘導技術和倍性鑒定方法等方面不斷深入研究，取得了一定的成果。本文將基于中國知網(China national knowledge internet，CNKI)和Web of Science核心合集數據庫(WOS)，對植物染色體加倍研究發展趨勢以及禾本科牧草染色體加倍和鑒定方法進行詳細綜述。

1 基于Citespace的植物染色體加倍發展趨勢分析

為全面了解全球植物染色體加倍相關研究現狀和前沿趨勢，更好地把握最新的研究動態，利用CiteSpace軟件分別對1999—2020年收錄在CNKI和WOS中的有關植物染色體加倍的文獻進行時區視圖分析(圖1，圖2)。以CNKI數據庫中的期刊作為檢索大類，以“染色體加倍”為檢索主題，共檢索出文獻495篇，剔除會議等無關條目后剩余483篇有效文獻，以Refworks格式輸出其信息作為分析數據源，圖1顯示共有67個節點(nodes)，133條連線(links)，每個節點代表一個關鍵詞，節點越大所對應的關鍵詞出現頻次越多，連線越多則表示關鍵詞共現次數越多，它們之間連線粗細表示相互關系的強弱[11]?！叭旧w加倍”出現頻次最多，共出現了130次，“秋水仙素”次之，出現了105次，此外“多倍體”“染色體加倍”“單倍體”等節點外部有紫色圈，表明中介中心性較高，中心性分別為0.40，0.30和0.33；從中提取出12個突變詞，最早的“甘藍型油菜”這個研究熱點自2001年起持續了5年，隨著時間推移“藥用植物(2005—2010年)”、“氟樂靈(2009—2012年)”的突變強度也相對突出，“三倍體(2015—2020年)”是近6年來的主要研究熱點。WOS中以“Chromosome doubling(染色體加倍)”為檢索標題，共檢索出311篇文獻并以“全記錄與引用的參考文獻”格式輸出文獻信息作為分析數據源，圖2顯示共有128個節點(nodes)，378條連線(links)，colchicine(秋水仙素)、recombination(重組)、induction(誘導)、polyploidy(多倍體)、gene(基因)為出現頻次較多的前5個關鍵詞，出現次數依次為35，25，24，22和20；從中提取突變詞13個，“recombination(重組，1999—2010年)”最早作為研究熱點，之后是“flow cytometry(流式細胞術，2007—2012年)”和“gene amplification(基因擴增，2009—2014年)”，而近4年的研究熱點是“induction(誘導，2017—2020年)”。由此可以發現，染色體加倍研究有宏觀層面，也有微觀層面，總體呈現出從單一到多元化的趨勢。

圖1 基于CNKI的植物染色體加倍研究前沿時區視圖Fig.1 Time zone view of the frontier research of plant chromosome doubling based on CNKI

圖2 基于WOS的植物染色體加倍研究前沿時區視圖Fig.2 Time zone view of the frontier research of plant chromosome doubling based on WOS

2 禾本科牧草多倍體人工誘導方法

人工誘導禾本科牧草多倍體的方法主要有物理、生物、化學等方法。如表1所示,不同方法的誘導原理、材料類型、誘導效果及應用等均不同。其中物理方法是利用溫度驟變、離心力、電離輻射等處理植物材料從而誘導染色體加倍，該方法具有不確定性且誘導效率普遍較低，在禾本科牧草加倍中應用較少，僅有Randolph[12]、Dorsey[13]和韓玉琴[14]等利用高溫或低溫處理對一些糧食作物加倍時獲得成功。生物方法是通過有性雜交、體細胞雜交以及胚乳培養等方法獲得染色體加倍植株。有性雜交法通常以四倍體植株作為母本，授于二倍體植株的花粉以獲得三倍體植株，如鐘聲[15]將二倍體野生鴨茅(Dactylisglomerata)與四倍體栽培種進行雜交獲得了其三倍體，雖然三倍體鴨茅高度不孕，但卻可以作為一種寶貴的育種材料；賈燕妮[16]的研究表明四倍體小麥與二倍體山羊草(Triticumtriunciale)雜交形成的三倍體雜種F1理論上自交不育，但卻由于它的母本四倍體小麥未減數配子的基因作用使F1發生染色體加倍而具有較低的結實率。胚乳培養法因其生產無核品種，在水果三倍體培育中備受追捧[17-19]，但由于其結實率低，因而在禾本科牧草中應用較少?；瘜W方法是利用化學誘導劑處理植株生長點的實體細胞或離體組織，從而誘導染色體加倍，與物理、生物方法相比，該方法誘導效率高、成本低且較穩定，因而應用最普遍。

2.1 影響化學方法誘導禾本科牧草染色體加倍的主要因素分析

化學方法誘導禾本科牧草染色體加倍最為普遍，因此表2按時間順序對CNKI和WOS中40篇有關化學方法誘導禾本科牧草染色體加倍時外植體類型、處理方法、加倍試劑的適宜濃度、時間與溫度以及倍性鑒定技術等主要影響因素進行分析總結。

2.1.1化學加倍試劑的種類 化學加倍試劑主要有秋水仙素(Colchicine)、氟樂靈(Trifluralin)、甲酰胺草磷(Amiprophose methyl，APM)、氨磺樂靈(Oryzalin)等。在不同的化學加倍試劑中，因秋水仙素誘導多倍體高效且可靠而被普遍應用(表2)。也有部分研究顯示秋水仙素雖然誘導率較高，但由于其毒性較大，且導致成活率較低，因此在使用秋水仙素誘導時應嚴格控制處理條件。也有一些研究認為在禾本科牧草多倍體誘導中使用其它加倍試劑效果較好，如Salon等[20]在誘導鴨茅狀摩擦禾愈傷組織加倍時，發現使用APM加倍效果較秋水仙素好；Quesenberry等[21]使用氨磺樂靈、秋水仙素、氟樂靈誘導巴哈雀稗加倍時表明氨磺樂靈誘導效果最好，它和微管蛋白之間的親和性高，可以形成氨磺樂靈-微管蛋白復合體，秋水仙素誘導效果次之。由此可見，加倍劑的誘導效果并不是絕對的，同一種化學加倍試劑對不同植物材料的誘導效果不同，適宜加倍劑的選擇是影響加倍效果的關鍵因素。

2.1.2外植體材料類型 外植體類型是影響多倍體誘導效率的另一個主要因素[22-23]。誘導禾本科牧草染色體加倍時可供使用的外植體材料有愈傷組織、莖段、胚芽、分蘗芽、種子、幼苗、植株等。圖3顯示，誘導禾本科牧草最常用的外植體為種子，占27.6%，其次是愈傷組織，占25.9%，幼苗、分蘗芽分別為20.7%，13.8%，而其它幾種外植體材料占12%。由表2可知，對同一種植物的不同外植體材料進行多倍體誘導時效果不同，如云嵐[24]誘導新麥草(Psathyrostachysjuncea)的種子、分蘗芽、愈傷組織加倍時，得出在離體條件下誘導愈傷組織時，誘導效率最高，達到了53.58%；而張秀麗[25]分別對新麥草的種子、胚芽以及幼苗加倍時，發現以幼苗為外植體，誘導率達到了62.5%；Quarin等[26]在對百喜草(Paspalumnotatum)的研究中也得出，與萌發的幼苗相比愈傷組織作為外植體時其誘導率更高，為74.00%。因此，適宜外植體的選擇是誘導成功的一大決定因素。

表1 禾本科牧草染色體加倍方法比較Table 1 Comparison of chromosome doubling methods for grasses

圖3 秋水仙素誘導禾本科牧草加倍時外植體類型比例Fig.3 Colchicine induces the percentage of explant types to double in grasses/%

2.1.3化學誘變劑的處理濃度、時間與溫度 化學誘變劑處理濃度、時間和溫度是影響染色體加倍效率的主要參數，且3者之間存在明顯的交互作用。表2中列出了秋水仙素誘導不同禾本科牧草染色體加倍的適宜濃度、時間和溫度，一般誘導濃度范圍在0.01%～0.3%，時間范圍在1～72 h，溫度范圍在15℃～30℃，可見不同植物同一外植體或同一植物不同外植體的最適處理濃度、時間和溫度均存在顯著差異。隨著秋水仙素處理濃度增加，染色體誘導率增大，但相應地細胞死亡率增加。一般高濃度處理時間宜短、低濃度處理時間相對延長時進行誘導處理效果較好，如鐘聲等[27]對鴨茅進行加倍時所選的適宜處理濃度和時間為0.05%，48 h或0.2%，24 h，而F. Wit[28]對意大利黑麥草加倍時選擇0.1%，2 h或0.2%，1 h。大多數相關研究沒有進行溫度控制設置，但王桂花等[29]在誘導巨大賴草染色體加倍時，進行了不同溫度梯度控制，結果顯示在15℃時處理其種子效果最好，溫度過高、過低都不利于誘導四倍體的產生。也有研究表明，秋水仙素處理濃度與溫度之間的互作效應要大于濃度與時間之間的互作效應[24]。因此，選擇適宜的處理濃度、時間與溫度，可以在很大程度上提高多倍體誘導率。

2.1.4化學誘導處理方法 化學誘導處理方法主要包括浸泡法、包埋法、滴液法、注射法、涂抹法等。對禾本科牧草而言，其中浸泡法使用最多，占所有方法的91.38%，并且在浸泡法中以種子浸泡最為常見[62]。與實體誘導相比，離體誘導染色體加倍具有重復性高、試驗條件易控制、誘導率高、嵌合體少等優點[63]，因而近年來離體誘導法被廣泛應用。如對新麥草愈傷組織進行誘導后，多倍體效率達到了53.58%，比對萌對動種子和分蘗芽實體細胞染色體加倍分別高29.18%和10.93%[24]；云玲格[59]通過離體誘導披堿草(Elymuscanadensis)×野大麥(Hordeumbrevisubulatum)雜種F1愈傷組織時，也同樣得到了較高的誘導率。

表2 秋水仙素誘導禾本科牧草染色體加倍Table 2 Colchicine induces chromosome doubling in grasses

續表2

續表2

續表2

續表2

2.1.5其它條件 除以上影響化學方法誘導染色體加倍的因素外，通常在處理液中添加一定濃度的二甲基亞砜(DMSO)能夠增加細胞的通透性，從而增加細胞對誘導劑的吸收，并且在處理時使用振蕩器或搖床震蕩，并針對不同的外植體材料選擇適宜的震蕩速度可以使外植體與秋水仙素溶液充分接觸，增強秋水仙素在細胞中的滲透，從而提高多倍體誘導率。

3 多倍體植物的倍性鑒定

多倍體植物的鑒定是多倍體育種中的一個重要環節。通常進行禾本科牧草倍性鑒定的方法有染色體計數、形態學、細胞學、流式細胞術(FCM)、核仁數目與核型分析、生理生化指標、逆境脅迫、分子水平鑒定等。其中染色體計數法是最基礎且常用的方法，而近年來以FCM作為首選方法測定植物細胞核DNA含量和倍性水平的研究越來越多，主要由于FCM與其他技術相比，提供的結果準確而不復雜，并允許在短時間內分析大量目標植物[64]。表3總結了常用倍性鑒定方法的原理、優缺點并且統計了不同鑒定方法的應用比例，為之后的一系列研究選擇合適的鑒定方法提供理論基礎。

4 多倍體的應用

4.1 培育多倍體牧草新品種

誘導形成的多倍體植株具有巨型性以及其抗病蟲害、抗逆性增強等特點，從而可以獲得優質、高產的禾本科牧草新品種。染色體加倍后會使植物生理生化指標改變，如二倍體黑麥草加倍為四倍體后不僅水分和可溶性碳水化合物的含量增加，改善了適口性，而且增強了抗病性和耐旱性[40]。

4.2 克服雜交后代的不育性和不結實性，使種間雜種的育性得到恢復

加拿大披堿草與野大麥雜交后代F1為三倍體，雜種F1的花藥又小又薄，不開裂，花粉育性僅為1.19%，并且在開放授粉條件下不結實，通過對雜種F1染色體加倍后其育性得到了恢復，成功創造六倍體加拿大披堿草—野大麥新種質[42]。Salon等[20]對鴨茅狀摩擦禾(Tripsacumdactyloides)的研究中顯示人工誘導加倍后的四倍體有性雌花兩性花同株植株與無融合生殖的雌雄同株四倍體植株作為花粉親本雜交，將產生可育后代。

4.3 形成遠緣雜交育種的中間親本

多倍體作為基因轉移的媒介作用時，可以促進不同植物分類單位之間的遺傳傳遞，如四倍體小麥與二倍體山羊草雜交創制了雙二倍體，它可以作為“橋梁”與小麥雜交和回交，從而將山羊草的優良遺傳物質轉移到小麥，可以豐富遺傳多樣性[16]。

表3 禾本科牧草多倍體鑒定方法Table 3 Polyploid identification method of grasses

5 問題與展望

禾本科牧草多倍體的研究在過去的幾十年里取得了顯著成效，前人闡明了它們產生的原因和后果，發現多倍體化是推動物種形成和進化的主要力量，對植物進行染色體加倍可以改變其基因組的結構，提高它對環境的適應性以及豐富物種遺傳多樣性等方面的優勢，從而獲得優良的植物特性。然而，由于禾本科牧草多倍體化這一過程的復雜性，多倍體試驗的成功率高度可變，目前還沒有一個完整的多倍體化方案。秋水仙素誘導禾本科牧草染色體加倍的整體誘導率在0%～94.69%之間，引起這種結果的原因是誘導率的評估程序不同，如計算誘導率可根據處理植株的數量或存活植株的數量計算，并且多倍體化的百分比有時包括混倍體，有時卻將加倍植株與混倍體分開。此外人工誘導染色體加倍效率取決于諸多因素，如植物種類、化學加倍試劑的種類、外植體類型和處理濃度、時間與溫度以及處理方法等，這些參數之間的交互作用非常高，其中任何一個條件改變都會對誘導率產生一定程度的影響，所以可以通過調節幾個參數來獲得較高比例的多倍體。目前誘導多倍體形成時產生的嵌合體現象仍是主要難題，這種現象通常導致誘導形成的同倍性多倍體出現的頻率較低。因此，闡明植物基因組中多倍體的作用，并且深入了解多倍化后基因組變化與新表型表達之間的關系，并將發生在基因組和轉錄組水平上的遺傳變化與發生在表型水平和個體適應性水平上的變化聯系起來，以確定在多倍體中觀察到的遺傳和表型變化是否真的具有適應性等問題仍有待深入研究。這不僅使禾本科牧草的改良具有良好的發展前景，同時可以使植物育種家更高效準確地操縱多倍體基因組并取得顯著成效。隨著禾本科牧草在畜牧業應用和發展中的不斷擴展，多倍體誘導產生的禾本科牧草新品種將對高產、速生、優質、抗逆性強等特征更加重視，而現代育種技術的發展也必將解決這些難題，使禾本科牧草育種工作更加持續而高效的發展。