母體孕期維生素D缺乏誘發胎兒生長受限

付 林，陳遠華，于 震，王 華，趙 卉，徐德祥

(1.安徽醫科大學第二附屬醫院，呼吸與危重癥醫學科，安徽 合肥 230041; 2.安徽醫科大學公共衛生學院，安徽 合肥 230031)

胎兒宮內生長受限(fetal intrauterine growth restriction，IUGR) 是指胎兒未能達到其遺傳決定的全部生長潛能[1]。IUGR不僅與死胎風險的增加有關，同時也是造成圍產期胎兒高發病率和死亡率主要原因[2]。維生素D (vitamin D，VD)是一種甾體類固醇激素，近年來母體孕期維生素D缺乏(vitamin D deficiency，VDD)與IUGR的關系受到越來越多的關注，流行病學發現孕期VDD增加了IUGR的發生風險[3]，但是機制不清。因此，本研究旨在通過低維生素D飼料喂養構建VDD誘發IUGR孕鼠模型，并從胎盤糖皮質激素屏障功能方面探討VDD誘發IUGR的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑本研究所用小鼠均為SPF級CD-1小鼠，購于北京維通利華公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2017-0012。4周齡雌鼠體重(19～21)g，飼養在恒溫恒濕環境中，自由飲水和進食，維持恒定晝夜節律。適應性喂養1周以后，隨機均勻分成對照組(CTRL組)和維生素D缺乏組(VDD組)。正常飼料和低維生素D飼料購買于南京特洛菲公司。糖皮質激素試劑盒購買于武漢華美生物公司。小鼠11β-HSD2引物由上海生工技術有限公司合成。一抗購于美國Abcam公司。

1.2 動物模型的制備實驗動物隨機分為2組：對照組(CTRL組)、維生素D缺乏組(VDD組)，每組雌鼠40只。CTRL組小鼠喂養標準飼料(VD含量>800 IU·kg-1)，VDD組小鼠飼養在無紫外光照的房間中，并喂以低維生素D飼料(VD含量<25 IU·kg-1)。飼養5周以后，每組隨機取6只雌鼠，異氟烷麻醉小鼠，摘眼球取血、脫臼處死小鼠，檢測血清中25-(OH)-D水平。剩余36只雌鼠與正常雄鼠交配，在妊娠d 16剖殺6只孕鼠，留取胎盤；在妊娠d 19剖殺剩余孕鼠，觀察妊娠結局。

1.3 蛋白免疫印跡取胎盤勻漿，吸取上清液并離心，吸取上清液250 μL，煮沸變性，所得即為胎盤總蛋白。接下來進行SDS-PAGE電泳，組裝灌膠卡槽，灌入合適高度的分離膠和濃縮膠。然后使用微量進樣器加入等量的蛋白樣品，開始電泳。電泳結束后剪下所需分子量的凝膠，進行轉膜，孵育一抗和二抗，發光顯影、拍照并分析灰度值。

1.4 酶聯免疫吸附實驗所有試劑盒于室溫中復溫30 min，建立標準曲線。在酶標板中加入標準品和待測血清，孵育一抗和二抗，加入顯色液繼續反應，最后用酶標儀檢測吸光度值[4]。

1.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應取胎盤加入TRIzol勻漿，用氯仿萃取RNA，加入異丙醇，輕輕顛倒搖晃EP管。然后4 ℃ 15 000×g離心10 min，留下沉淀，干燥RNA。加入適量無酶水，溶解RNA并定量至500 μg·L-1。取2 μg RNA進行逆轉錄，反應結束進行后續的PCR實驗[5]。

2 結果

2.1 孕期維生素D缺乏誘發IUGR維生素D缺乏 (VDD)飼料喂養小鼠，5周后檢測血清25-(OH)-D水平。結果Tab 1所示，VDD組小鼠血清中25-(OH)-D水平低于CTRL組(5 μg·L-1vs23 μg·L-1)。在孕d 19剖殺孕鼠，發現兩組孕鼠在活胎、死胎以及吸收胎上無差異。稱量胎鼠重和胎盤重，結果發現VDD組胎鼠重和胎盤重低于CTRL組。此外，VDD組胎鼠身長和胎盤直徑均低于CTRL組,見Tab 1。

Tab 1 The pregnancy outcome of mice in two

2.2 孕期維生素D缺乏損傷胎盤糖皮質激素屏障功能我們檢測了胎盤11β-HSD2的表達水平，結果發現VDD組胎盤11β-HSD2蛋白和mRNA水平低于CTRL組；此外，胎血中糖皮質激素水平也被檢測，我們發現VDD組胎鼠中GC水平高于CTRL組[(315.6±18.32) ng·L-1vs(506.3±23.46) ng·L-1]。

3 討論

本研究通過低維生素D飼料喂養成功構建VDD小鼠模型，發現VDD組和CTRL組在活胎、死胎以及吸收胎數上無差異；孕期VDD減輕了胎鼠和胎盤重，降低了胎鼠身長和胎盤直徑。以上結果表明，母體孕期VDD可誘發IUGR，但機制不明。Ⅱ型11β-羥基固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2, 11β-HSD2)是一類重要的糖皮質激素代謝酶。研究發現[6-7]，胎盤11β-HSD2能夠代謝有生物學活性的皮質醇為無生物學活性的皮質酮，預防母體內過多的GC透過胎盤進入胎兒體內，維持正常發育。本研究發現11β-HSD2表達在VDD組胎盤上降低，GC水平升高。以上結果提示，母體孕期VDD可能通過下調胎盤11β-HSD2表達，導致母體內過多GC進入到胎兒體內進而誘發IUGR。