BoneCeramic和Bio-Oss骨粉對狗骨髓間充質干細胞體外成骨分化能力影響的比較研究

路佳佳，李偉瓊，許 敏，徐 濤，朱友明，徐建光，張紅艷

(1. 安徽醫科大學附屬口腔醫學院，安徽省口腔疾病研究中心實驗室，2.安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032)

自體骨移植一直被認為是治療頜面骨組織缺損的金標準[1]，但是自體骨的采集需要開辟二次術區，導致額外的并發癥，患者常常難以接受[2]，因此，人們對骨移植替代物的關注越來越大。“最佳”的骨移植替代物不僅要有良好的生物相容性和促成骨分化性能，還需具有合適的降解速率[3]。臨床上最常見的修復口腔頜面部缺損的骨移植替代物是Bio-Oss (Geistlich Pharma，Wolhusen，Switzerland)。Bio-Oss屬于天然的異質骨移植物，是一種商品化的去蛋白牛骨礦物質，由高孔隙率的羥基磷灰石晶體組成，它提供了充足的表面積，為成骨細胞的遷移和粘附提供了良好的相容性和機械穩定性[4-5]。但在移植后，Bio-Oss的降解速率非常緩慢。文獻報道在植入后數年，體內仍可觀察到Bio-Oss骨粉材料殘留[6]。臨床上Bio-Oss骨粉通常被用在口腔種植領域，以減少術后骨重建所導致的骨質喪失。

近年來，隨著組織工程學的不斷發展，一種新的100%合成骨移植替代物BoneCeramic(Straumann，Basel，Switzerland)已正逐漸用于骨缺損的修復治療[7]。BoneCeramic是一種雙相磷酸鈣，由60%的羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和40%的β-磷酸三鈣組成，孔隙率高達90%，相互連通的孔直徑為100-500μm。文獻報道[8-9]，移植后，β-磷酸三鈣可以迅速地吸收并被再生骨完全取代,與此同時，吸收速度緩慢的HA可作為新血管向內生長和成骨細胞附著的良好支架。

骨髓來源的間充質干細胞因其強大的增殖能力、卓越的成骨分化潛能等[10], 成為目前骨組織工程首選的種子干細胞[11]。其中，狗骨髓間充質干細胞(dog bone marrow mesenchymal stem cells，DBMSCs)具有取材方便, 能夠迅速擴增，并在擴增過程中保持多向分化潛能，同時在特定的環境下能分化為成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等優點，因此，本研究選擇了狗骨髓間充質干細胞。

目前，由于缺乏對這兩種骨粉材料之間標準化的直接科學比較，合成骨移植材料的促成骨分化性能是否優于天然骨移植材料仍然值得探究。因此，本研究旨在比較BoneCeramic骨粉與現今臨床上廣泛使用的Bio-Oss骨粉對DBMSCs體外成骨分化能力的影響，為骨替代材料的臨床選擇和應用提供一定的指導和建議。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器和試劑♂健康比格犬，購于儀征安立卯生物科技有限公司(No 20201207)。BoneCeramic (Straumann，Switzerland，VR294)；Bio-Oss(Geistlich Pharma, Switzerland，81901307);胎牛血清((杭州四季青生物科技公司,18120502);胰酶消化液(上海碧云天生物技術有限公司，121920191228)、DMEM培養液(美國Gibco公司,AF29498406);PBS緩沖劑(美國Solarbio公司，AF29561133);CCK-8試劑(日本同仁公司，SD787);CO2恒溫孵箱(美國Therno公司);茜素紅(美國Sigma公司，MKCF4917);油紅O(美國Sigma公司， 20190424);堿性磷酸酯酶試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，061820200929) ;PCR引物(上海生物工程股份有限公司);實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司);酶標儀(美國Bio-tek公司);

1.2 方法

1.2.1比格犬骨髓干細胞(DBMSCs)的體外分離培養 比格犬經3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，選取髂后脊為穿刺點，碘伏消毒，16號骨穿刺針穿刺,回抽見混有脂滴的血液，證實為骨髓,內盛500 uL肝素溶液的20 mL注射器抽取10 mL骨髓,加入PBS緩沖液1 ∶1混勻后，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中，用密度梯度離心法培養原代細胞，該細胞記為P0代。每隔3 d換液，待細胞達到80%-90%融合，加入0.25%胰酶消化細胞進行傳代培養，此傳代細胞記為P1代，細胞代數標記以此類推。

1.2.2DBMSCs成骨、成脂誘導分化 P3代DBMSCs以5×105個/孔接種于6孔板中，將培養基更換為相應的成骨、成脂誘導培養基。培養21 d后，棄掉上清液，4%甲醛固定30 min，PBS清洗2次，分別進行茜素紅染色，顯微鏡下觀察細胞礦化結節的形成；進行油紅O染色,顯微鏡下觀察細胞中脂滴的形成。

1.2.3CCK-8檢測兩種骨粉浸提液對DBMSCs細胞增殖的影響 無菌條件下分別取Bio-Oss和BoneCeramic兩種骨粉顆粒，將顆粒加入含10% FBS的DMEM培養基浸泡(濃度為0.1 kg· L-1)，浸泡48 h后獲得浸提原液,過濾后備用。將DBMSCs以4×107個·L-1的密度接種在96孔板中，培養24 h細胞貼壁后，將原培養液更換為浸提原液,對照組不更換培養液，每3 d換液。分別在培養1、3、5 d，加入CCK-8工作液，置于恒溫培養箱2 h，隨后在450 nm波長處檢測各孔的吸光度。每組設8個復孔，實驗重復3次。

1.2.4SEM觀察DBMSCs在骨粉表面黏附的情況 無菌環境下，將Bio-Oss和BoneCeramic顆粒分別放入15 mL離心管中，加入密度為1×109個·L-1的DBMSCs，培養3 d后，小心吸出培養液，加入2.5%掃描電鏡專用戊二醛，4 ℃固定細胞12 h后，去除戊二醛，PBS洗滌3次。采用60%、70%、80%、90%和100%的無水乙醇對細胞進行梯度脫水，每步脫水20 min，臨界點干燥，完成后鍍金90 s，將鍍金后的顆粒于掃描電子顯微鏡下進行觀察。

1.2.5ALP定量檢測 無菌環境下，將Bio-Oss和BoneCeramic顆粒分別平鋪于6孔板皿底中，DBMSCs以5×105個/孔的密度滴入其中，培養1 d后，將生長培養基(growth medium，GM)更換為成骨培養基(osteogenic medium，OM)，每2 d換液。Bio-Oss植入細胞(OM)：A組，BoneCeramic植入細胞(OM)：B組,純DBMSCs(OM)：C組，純DBMSCs(GM)：D組。應用堿性磷酸酶試劑盒檢測成骨誘導4、7、10 d后細胞培養上清中堿性磷酸酶的水平。按照堿性磷酸酶測定試劑盒操作說明，于酶標儀405 nm檢測各孔吸光光度值，按照公式計算細胞培養上清堿性磷酸酶的含量。實驗重復3次。

1.2.6qRT-PCR檢測 如上，按照ALP定量檢測的分組方法和操作步驟，分別于7、14 d后提取細胞總RNA,進行RT-PCR定量檢測核心結合因子2 (RUNX2)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素( OCN)、骨橋蛋白(OPN)基因表達水平。按TRIzol試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，使用PrimeScriptTM-PC R kit逆轉錄試劑盒合成cDNA,以此為模板,用目的基因的引物進行擴增和檢測。實驗重復3次。PCR引物序列見Tab 1，其中GAPDH為內參。

Tab 1 Primers used for quantitative real time PCR

2 結果

2.1 DBMSCs的體外分離培養密度梯度離心法培養DBMSCs，約3-6 d光鏡下可觀察到原代細胞開始貼壁，為橢圓形或短梭形，有伸展突起，隨著培養時間增加，細胞開始變為長梭形或多角形，經2次傳代后即可獲得細胞形態均一、貼壁能力強、易于消化的梭形DBMSCs。見Fig 1。

Fig 1 Microscopic morphology of DBMSCs A: DBMSCs on day 5; B-C: DBMSCs of the P2, Magnification: B ×8; C ×16

2.2 DBMSCs的成骨、成脂分化DBMSCs成骨誘導顯示誘導21 d后茜素紅染色可見大量紅染的礦化鈣鹽結節沉積；成脂誘導顯示誘導21 d后細胞內可形成脂滴團, 油紅O染色后呈鮮紅色脂滴泡。見Fig 2。

Fig 2 Osteogenic and lipogenic differentiation of DBMSCs(50×)A: Alizarin red staining; B: Oil red O staining

2.3 CCK-8檢測兩種骨粉浸提液對DBMSCs細胞增殖的影響在加入浸提液的d 1、3、5，Bio-Oss組和BoneCeramic組細胞OD值相較于對照組均有增高，差異有統計學意義(P<0.05)，BoneCeramic組的細胞數量要比Bio-Oss組略高，但差異沒有統計學意義(P>0.05)。見Fig 3。

2.4 掃描電子顯微鏡(SEM)檢測Fig 4是DBMSCs接種3 d后在Bio-Oss和BoneCeramic兩種骨粉支架材料上的典型掃描電鏡圖像。在Bio-Oss表面觀察到少數分離的DBMSCs，與Bio-Oss相比，DBMSCs在BoneCeramic骨粉表面分布的更加廣泛。見Fig 4。

2.5 ALP定量檢測d 4，A組、B組、C組ALP活性均高于D組，差異有統計學意義(P<0.05)，A組、B組、C組3組之間無明顯差異; d 7, A組、B組、C組ALP 活性均高于D組，A組、B組活性高于C組，B組高于A組,差異有統計學意義(P<0.05);d 10, A組、B組、C組ALP 活性均高于D組，A組、B組活性高于C組，B組高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。見Fig 5、Tab 2。

Fig 3 Effect of bone powder extracts on proliferation of *P<0.05 vs control group

Fig 4 Scanning electron microscopy (SEM)Distribution of DBMSCs on the surfaces of Bio-Oss and BoneCeramic after 3 days of inoculation, the blue arrow points to the cell. Magnification:× 500(a,c);×1000(b,d)

Fig 5 ALP quantitative detection n=6)Group A: Bio-OSS+DBMSCs (OM), Group B: BoneCeramic+DBMSCs (OM), Group C: DBMSCs(OM), group D: DBMSCs(GM) . *P<0.05 vs Group D; #P<0.05 vs Group C; &P<0.05 vs Group A

Tab 2 OD value in ALP quantitative

2.6 qRT-PCR檢測檢測成骨相關基因(OPN、OCN、RUNX-2、ALP)在d 7、14的相對表達水平。結果表明：與對照D組相比，A、B、C 3組的mRNA水平在這幾種成骨相關基因中都要顯著增高，同時，B組(BoneCeramic+細胞)要高于A組(Bio-Oss+細胞)，差異有統計學意義(P<0.05)。也就是說明DBMSCs在BoneCeramic表面要比Bio-Oss更加有利于其成骨分化。見Fig 6。

3 討論

目前，臨床上最常見的骨移植材料包括自體骨、同種異體骨、異質骨以及合成骨移植材料[12]，自體骨是骨移植的金標準，但由于需要二次手術，限制了其使用，同種異體骨可以很好的避免二次手術的問題，但存在著免疫原性的問題[13]，非人類源性的異質骨則會比同種異體骨導致更明顯的免疫學問題，比如瘋牛病或牛海綿狀腦炎(BSE)[14]。這使得合成骨移植材料在臨床上的運用越來越廣泛，BoneCeramic是一種新型的純合成骨移植材料，在臨床上投入廣泛使用之前，必須先在體外細胞實驗中進行測試。這項研究的目的是比較Bio-Oss和BoneCeramic兩種骨粉材料對DBMSCs成骨分化的影響。

CCK-8細胞增殖實驗表明，浸泡了48h的Bio-Oss和BoneCeramic骨粉浸提液對DBMSCs的增殖沒有抑制作用(Fig 3)；掃描電子顯微鏡(SEM)結果顯示，相較于Bio-Oss，DBMSCs在BoneCeramic表面分布的更加廣泛(Fig 4)。ALP堿性磷酸酶定量檢測的結果得出(Fig 5，Tab 2)，A組(Bio-Oss植入細胞)和B組(BoneCeramic植入細胞)與沒有加入骨粉支架的C組相比，ALP的活性明顯增高，說明DBMSCs黏附在骨粉支架表面要比單獨的細胞更有利于其成骨分化，這主要是由于骨粉材料的空間結構和三維支架結構拓展了細胞的生長空間，使得細胞和材料的接觸面積變大，減少了接觸抑制，從而更加有利于DBMSCs的成骨分化。同時B組的ALP活性高于A組，說明在DBMSCs黏附在BoneCeramic表面更有利于成骨分化。qRT-PCR檢測第4、7、10天相關成骨基因(OPN、OCN、RUNX-2、ALP)的相對表達水平也證實了ALP的結果(Fig 6)。綜上所述，Bio-Oss和BoneCeramic這兩種骨粉材料對狗骨髓干細胞的細胞毒性均很低，同時，相較于Bio-Oss，BoneCeramic能更加的促進狗骨髓干細胞的增殖和成骨分化。

Fig 6 Expression of genes related to osteogenic differentiation detected by RT-PCR(n=5)A: Bio-OSS+DBMSCs (OM)； B: BoneCeramic+DBMSCs (OM) ； C: DBMSCs (OM)； D: DBMSCs (GM) . *P<0.05 , **P<0.001 vs Group C; ▲P<0.05，▲▲P<0.001 vs Group A.

除了生物相容性和成骨性之外，材料的降解也是組織工程學的重點[15]。BoneCeramic是一種雙相磷酸鈣，由60%的羥基磷灰石(HA)和40%的β-磷酸三鈣組成。HA有著與人體骨骼高度相似的生物相容性和較低的溶解度，因此，廣泛的運用在組織工程學中作為細胞附著的良好支架。β-磷酸三鈣是一種生物相容性磷酸鈣，已被成功的運用到口腔種植上頜竇提升術中，β-磷酸三鈣它有一個相對較晚的重塑期，它的降解主要是通過物質的化學溶解而不是破骨細胞的再吸收。BoneCeramic結合了HA的生物相容性和β-磷酸三鈣的良好吸收性，在促進骨再生的同時，BoneCeramic可以在較短的時間內完全被吸收并被再生骨所取代[16]。因此，在需要材料降解的骨組織工程里，也許BoneCeramic會是一種很好的材料。

本文主要研究一種新型的純合成骨粉材料BoneCeramic，經過一系列體外實驗的結果表明，BoneCeramic與臨床廣泛使用的Bio-Oss相比，有著同樣優異的生物相容性，在成骨性能方面甚至要高于Bio-Oss。在未來，應該測試Bio-Oss和BoneCeramic的體內生物相容性和成骨性。目前尚不清楚BoneCeramic是如何支持DBMSCs的增殖的，也許應該進行一些研究以了解其中的機制作用，這會更加有利于BoneCeramic在臨床上的廣泛運用。