SAHA-CTSV軸通過誘導過度自噬抑制乳腺癌MCF-7細胞的生長

周 慧，韓 翰, 周偉強

(沈陽醫學院 1. 組織學與胚胎學教研室、2. 生物化學與分子生物學教研室、3. 病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110034)

癌癥被認為是世界上每個國家的主要死亡原因和延長預期壽命的重要障礙，據我國腫瘤登記中心的數據資料顯示，乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在近十幾年呈現上升趨勢，居于城鄉女性第一位[1]。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)是一種二代組蛋白去乙酰化酶抑制劑，通過對細胞的核小體中的組蛋白乙酰化水平的調節，從而改變細胞染色質的結構，起到調節細胞轉錄因子的表達、細胞凋亡及細胞的誘導分化等相關的生理生化效應[2]。由334個氨基酸殘基組成的人組織蛋白酶V (cathepsin V，CTSV)，分子量約為37 ku，是一種溶酶體蛋白水解酶，定位于9q22.2染色體[3]。但是，CTSV在自噬中的作用還未見深入了解。本文將SAHA作用于乳腺癌MCF-7細胞，研究CTSV在SAHA誘導乳腺癌MCF-7細胞自噬中的作用和機制，為進一步明確SAHA-CTSV軸通過誘導過度自噬抑制乳腺癌MCF-7細胞生長的分子作用機制，提供相應的理論基礎和實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞株MCF-7(ATCC細胞庫)；RPMI 1640培養基(A4192301)、胎牛血清(A3160902)、青霉素及鏈霉素(KGY0023)(Thermo Scientific)；SAHA(1604-1)(Sigma-Aldrich)；Muse Count & Viability試劑盒(13-0618)(Millipore)；RNA提取試劑盒(1182866500)(Roche)；Power SYBR Green PCR Master mix(4367659)(Life Technologies)；抗體(Abcam Inc)；ECL化學發光試劑盒(B2162617)(Roche)；CTSV小干涉RNA( small interfering RNA，siRNA) (SC-44526-SH)(Santa Cruz)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人乳腺癌MCF-7細胞使用含10 %胎牛血清的RPMI 1640培養基(添加100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，在含有5 % CO2的培養箱中37 ℃培養。實驗時當細胞長至培養瓶底70%時，收集細胞調整濃度并接種到96孔板(1×107L-1)或6孔板(5×108L-1)。siRNA干擾實驗需將已貼壁細胞更換為無血清培養基進行同步化處理后再進行實驗。

1.2.2 Muse自動細胞分析儀檢測細胞活力配制濃度為0、0.5、1、2、5、10、20、50 μmol·L-1的SAHA，加入到細胞已貼壁的培養板中培養24 h，胰酶消化收集細胞，每組約2×105個，每組樣品加入Muse自動細胞分析儀檢測試劑Count & Viability reagent 450 μL，混勻室溫靜止，然后檢測細胞活力。

1.2.3CTSV siRNA轉染MCF-7細胞 根據Lipofectamine 3000轉染試劑使用說明，先將無血清培養基與適量lipofectamine 3000轉染試劑和CTSV siRNA分別混勻并室溫靜止5 min，然后再將兩種混合液移到1.5 mL離心管中混勻后靜止5 min。將轉染復合物加至培養板中培養24 h后繼續后面操作。

1.2.4RNA提取和實時熒光定量PCR檢測mRNA水平 將SAHA與MCF-7細胞共同孵育24 h，按照RNA提取試劑盒說明進行，合成第一鏈cDNA后應用SYBR Green方法進行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內參進行作用，觀察mRNA變化。每個樣品設3個復孔，數據分析采用2-ΔΔCT方法。Beclin 1引物序列：Forward為5′-AGGTTGAGAAAGGCG AGACA-3′，Reverse為5′-GCTTTTGTCCACTGCTCCT C-3′；ATG12引物序列：Forward為5′-AGGTCTGT AGTCGCGGAGAA-3′，Reverse為5′-GTTCCCGGCT AGTCATTCAA-3′；ATG10引物序列：Forward為5′-GCATTGTAGGGCCAGTTGTT-3′，Reverse為5′-GCT GGCCAGGTAAACTCTTG-3′；ATG9A引物序列：Forward為5′-GTCAGCTGCGTGGACTATGA-3′，Reverse為5′-GACTTGAGCAGGCAAAAAGG-3′；ATG7引物序列：Forward為5′-GAACATGGTGCTGGTTTCCT-3′，Reverse為5′-CATCCAGGGTACTGGGCTAA-3′；ATG5引物序列：Forward為5′-GCAAGCCAGACAGGAAA AAG-3′，Reverse為5′-GACCTTCAGTGGTCCGGTA A-3′；ATG4B引物序列：Forward為5′-GAGCTGCC AAGTCCAGATTC-3′，Reverse為5′-CCAGGATTTTCA AAGGGACA-3′；ATG4C引物序列：Forward為5′-CCTTGGCTCTTTTTGGCTTA-3′，Reverse為5′-AGG ATGCCTTGCTTCTTCAA-3′；ATG3引物序列：Forward為5′-TTTGGCTATGATGAGCAACG-3′，Reverse為5′-GTGGCAGATGAGGGTGATTT-3′；ULK1引物序列：Forward為5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3′，Reverse為5′-TGGATCCAAGGCTCTAGGTG-3′；GAPDH引物序列：Forward為5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，Reverse為5′-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3′。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達水平 SAHA作用細胞24h后，收集細胞提取蛋白測定蛋白量；將蛋白含量調整一致后，SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜，4℃封閉過夜，然后經過一抗及二抗孵育，ECL化學發光，凝膠成像系統成像。

1.2.6細胞免疫熒光法檢測自噬水平 SAHA作用細胞24 h后，細胞清洗后用4 %甲醛室溫固定30 min，5 % BSA室溫封閉1 h，加入LC3抗體試劑4 ℃過夜孵育，細胞清洗后激光共聚焦顯微鏡掃描成像。

1.2.7自噬通量阻滯試驗 將0-40 nmol·L-1不同劑量的Bafilomycin A1與SAHA共同作用MCF-7細胞24 h。一部分細胞收集提取蛋白，利用Western blot檢測細胞自噬相關蛋白表達量從而確定最佳自噬抑制劑量。另一部分細胞在Bafilomycin A1存在下做CTSV-siRNA轉染實驗，實驗結束后收集細胞，然后檢測p62蛋白水平并進行細胞活力分析。

2 結果

2.1 SAHA對MCF-7細胞增殖的影響我們將SAHA(0-50 μmol·L-1)與MCF-7細胞作用24 h，通過Muse細胞分析儀測定細胞活力，以期找到SAHA對MCF-7細胞的最適濃度。如Tab 1數據結果顯示，不同濃度的SAHA作用細胞后，細胞的活力隨著濃度增加而逐漸降低，其中在5 μmol·L-1濃度的SAHA組，MCF-7細胞活率為70.8%，與對照組細胞活率88.5 %相比，細胞活率顯著降低，見Tab 1。結果表明，SAHA能顯著抑制MCF-7細胞的增殖。

Tab 1 Effect of SAHA on viability of MCF-7 breast cancer cells n=3)

2.2 SAHA對MCF-7細胞CTSV表達的作用為明確SAHA誘導乳腺癌細胞增殖中是否伴隨CTSV表達量的改變，我們測定了不同劑量SAHA誘導的MCF-7細胞CTSV的mRNA和蛋白水平。結果表明，SAHA處理后CTSV的mRNA和蛋白水平顯著升高。SAHA 5 μmol·L-1作用24 h后，檢測CTSV的mRNA水平，與對照組比較達到其93.7倍，同時CTSV的蛋白表達水平也顯著上升。實驗結果表明SAHA能促使MCF-7細胞中CTSV的基因和蛋白的表達增高，見Fig 1。此外，綜合SAHA的毒副作用，我們最終確定了SAHA對MCF-7細胞作用的最適濃度為5 μmol·L-1。

Fig 1 Assays for CTSV expressions induced by different doses of SAHA for 24 h treatment n=3)A： Western blot assay for MCF-7 cells; B： Real-time PCR assay for MCF-7 cells. *P<0.05 vs Basal.

2.3 CTSV-siRNA轉染對MCF-7細胞中CTSV的基因和蛋白水平的影響為驗證CTSV-siRNA是否成功轉染MCF-7細胞，我們用Real-time PCR和Western blot檢測敲減效果。實驗結果顯示，與對照組比較，SAHA組CTSV mRNA轉錄水平和蛋白表達水平最高，CTSV-siRNA組的CTSV mRNA轉錄水平和蛋白表達水平顯著下降，而SAHA+CTSV-siRNA組的CTSV mRNA轉錄水平和蛋白表達水平高于對照組，但明顯低于SAHA組，見Fig 2。這些結果表明，SAHA對CTSV具有上調作用，CTSV-siRNA可有效抑制CTSV mRNA轉錄和蛋白表達水平。

Fig 2 Effect of SAHA on MCF-7 breast cancer cells accompanied by increase of CTSV function n=3)A：Western blot assay for MCF-7 cells; B： Real-time PCR assay for MCF-7 cells. *P<0.05 vs Basal； #P<0.05 vs SAHA. (CVi: CTSV siRNA).

2.4 SAHA-CTSV對MCF-7細胞自噬標志物LC3表達的影響為了進一步探討SAHA-CTSV誘導乳腺癌細胞自噬的作用，利用激光共聚焦顯微鏡成像觀察SAHA-CTSV對細胞自噬標志分子LC3蛋白表達的影響。如Fig 3所示，SAHA作用細胞后，細胞自噬強度明顯增強；而CTSV-siRNA轉染后，LC3蛋白集中分布在細胞膜周圍，并呈散簇狀，熒光亮度也有所減弱。此外，觀察SAHA誘導CTSV siRNA干擾后的細胞自噬的影響發現，LC3蛋白熒光也分布在細胞膜周圍，但分布范圍小于未經SAHA處理細胞組，不過LC3蛋白熒光仍為塊狀分布，無明顯散簇狀，而且熒光亮度也強于未經SAHA處理細胞組。這些結果表明SAHA-CTSV能夠誘發MCF-7細胞發生高強度的自噬，升高LC3蛋白的表達水平。

Fig 3 Fluorescence microscopy for SAHA-CTSV induced autophagy (CVi: CTSV siRNA).

2.5 SAHA-CTSV對自噬相關ATGs分子和LC3的影響為更深入研究SAHA-CTSV誘導乳腺癌發生自噬的機制，特別是自噬相關分子ATGs和LC3在自噬過程中的變化。我們通過Real-time PCR和Western blot進行檢測，結果顯示，在MCF7細胞中，SAHA增強了ULK1、ATG4C、ATG5和ATG9A的功能，轉染的CTSV siRNA只抑制了ATG4C的表達，對其他ATGs活性沒有影響，見Fig 4。對相關蛋白表達水平分析，結果顯示當SAHA作用于MCF-7細胞時，細胞中ATG4C和Beclin1的表達量上升，而同時LC3B蛋白的表達量也隨之增加，但mTOR蛋白的表達量卻降低。CTSV表達被抑制后，SAHA誘導強自噬效應也隨之被降低，見Fig 5。結果表明SAHA-CTSV在MCF-7細胞自噬過程中起到重要作用。

2.6 Bafilomycin A1阻斷自噬通量對SAHA-CTSV抗腫瘤作用的影響我們通過Bafilomycin A1阻斷自噬的傳遞來驗證SAHA-CTSV對MCF-7細胞自噬的促進作用。首先，利用細胞自噬抑制劑Bafilomycin A1抑制SAHA對MCF-7細胞的自噬誘導作用，使用濃度分別為0、5、10、20、40 nmol·L-1的Bafilomycin A1與SAHA孵育的MCF-7細胞作用24 h。Western blot檢測結果顯示，與SAHA組相比，從5 nmol·L-1Bafilomycin A1開始，隨著抑制劑濃度的增加，p62蛋白的表達水平也隨之有顯著增加。其次，將5 nmol·L-1Bafilomycin A1和SAHA共同加入CTSV-siRNA的MCF-7細胞24 h，結果分析顯示在CTSV表達被抑制后，SAHA誘導細胞自噬并導致細胞死亡的作用被明顯降低，無法達到顯著的抗腫瘤作用。隨后的細胞活力分析結果顯示，與SAHA組相比，Bafilomycin A1和SAHA共孵育組中活細胞數量增加。此外，CTSV mRNA轉錄被抑制后，SAHA誘導細胞自噬的強度也隨之減弱，見Fig 6。結果表明，CTSV在SAHA誘導的MCF-7細胞自噬過程中起著重要的作用。

Fig 6 The anti-tumor effect of SAHA-CTSV in environment that autophagic flux was block by Bafilomycin A1 n=3)*P<0.05 vs Basal; #P<0.05 vs SAHA. (B: Basal, S: SAHA, CVi: CTSV siRNA, BA1: Bafilomycin A1).

Fig 5 Effect of SAHA-CTSV on protein expressions of autophagy related molecules Western blot assay for MCF-7 cells *P<0.05 vs Basal； #P<0.05 vs SAHA (CVi: CTSV siRNA).

Fig 4 The mRNA expressions of autophagy related molecules induced by SAHA-CTSV in MCF-7 breast cancer cells n=3)*P<0.05 vs Basal； #P<0.05 vs SAHA (CVi: CTSV siRNA).

3 討論

癌癥的發病率出現逐年增多的趨勢，全球每年新發病例將達到1406.8萬，其中乳腺癌是全世界女性癌癥發病之首[4-6]。作為二代組蛋白去乙酰化酶抑制劑，SAHA在許多生物學功能上起著極其重要的作用，已知的研究表明SAHA是通過抑制組蛋白去乙酰化酶活性，從而改變染色質的結構，在基因水平上調節細胞活動[7-9]。我們將SAHA與乳腺癌MCF-7細胞共同孵育，利用Muse自動細胞分析儀發現，SAHA可以降低MCF-7細胞活力，抑制 MCF-7 細胞增殖。CTSV又稱為組織蛋白酶L2，屬于半胱胺酸蛋白酶體系，是11種人半胱氨酸組織蛋白酶中的一員[10]，我們通過實時熒光定量PCR和Western blot證實，在SAHA抑制MCF-7細胞增殖時，CTSV的表達量顯著增加。

自噬是一種細胞內降解系統，通過降解蛋白質、細胞器和微生物等多種靶點，促進細胞內穩態[11-13]。自噬具有雙重性，一方面，自噬是一種保護機制，保護細胞受到藥物等外界一些刺激因素引起的死亡，進而產生耐藥。另一方面，保護也不是絕對的，當超過一定限度時，自噬可以誘導或參與細胞死亡，這就是自噬性細胞死亡，這也是腫瘤化療時的一種重要死亡方式。為了驗證自噬是否與SAHA誘導的細胞死亡有關，我們檢測了自噬標志物LC3，結果表明，SAHA能顯著促進MCF-7細胞中LC3的表達。利用siRNA干擾技術抑制CTSV轉錄后，在SAHA作用細胞時LC3蛋白的表達量也呈下降趨勢，與此同時細胞的死亡率也隨之下降。這些結果說明了在乳腺癌細胞因自噬而死亡的過程中SAHA-CTSV軸起著關鍵作用。

為進一步發現SAHA-CTSV軸誘導自噬發生發展的作用機制，本研究采用實時定量PCR和Western blot檢測自噬過程中的主要分子轉錄及表達情況。數據顯示當SAHA作用于MCF-7細胞時，細胞中ATG4C和Beclin1的表達量上升，而同時LC3B蛋白的表達量也隨之增加，但mTOR蛋白的表達量卻隨之降低。此外，我們用Bafilomycin A1阻斷自噬通量后，發現被SAHA抑制的細胞活力和p62蛋白的表達顯著增加。以上結果提示，SAHA-CTSV軸通過誘導乳腺癌MCF-7細胞的過度自噬發揮抗腫瘤作用。

總之，我們的實驗結果說明CTSV參與并介導了SAHA誘發MCF-7細胞自噬并死亡的過程。在SAHA誘導細胞自噬過程中，首先通過CTSV激活ATG4C和Beclin1調高其蛋白表達量，然后激活并誘導下游自噬關鍵分子LC3的合成，并伴有mTOR相關信號通路的轉導，最終引起MCF-7細胞過度自噬從而引發細胞死亡。綜上所述，本研究深入地闡明了SAHA-CTSV軸作用于乳腺癌MCF-7細胞調控增殖、誘導自噬性細胞死亡的分子機制，同時為解決SAHA的耐藥問題提供理論依據，拓寬乳腺癌研究方向，為更好地理解SAHA-CTSV軸在乳腺癌發生、發展中的規律提供了實驗依據。

(致謝：衷心感謝沈陽醫學院遼寧省環境污染與微生態重點實驗室為本實驗提供的實驗設備，感謝實驗室全體工作人員對本實驗的大力協助。)