大鼠心臟驟停后行心肺復蘇對海馬腦組織的影響及機制

夏 威，戴錦辰，周文瀚，陳萌檬，楊 旻，陳曉宇

(安徽醫科大學 1.第二附屬醫院重癥醫學科， 安徽 合肥 230601； 2. 臨床醫學院、3.形態學實驗中心，安徽 合肥 230032)

心臟驟停(cardiac arrest，CA)是臨床較為常見的急危重癥，隨著心肺復蘇(ceardiopulmonary resuscitation，CPR)技術的推廣和應用，CA患者的自主血液循環恢復率和存活率顯著增加，但CA患者常出現神經功能損傷，故腦復蘇在心肺復蘇后非常重要[1]。CPR后的患者存在缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)，腦組織對機體缺血缺氧最為敏感[2]。在CA和CPR過程中，患者經歷嚴重缺血缺氧/再灌注的應激性病理過程，氧化應激損傷始終貫穿在該病理變化進程中[3]。氧化應激與很多疾病的發病有關，線粒體產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)升高，機體內源性抗氧化系統的平衡遭受破壞，抗氧化失衡現象[4]。核因子E2相關因子(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是氧化應激的關鍵轉活因子，結合Kelch 樣ECH相關蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)后，可恢復機體氧化失衡的狀態[5]。CPR后IRI存在急性腦缺血疾病和氧化應激損傷，但Nrf2-Keap1信號通路在心臟驟停后腦損傷的機制研究中文獻報道較少，該研究從海馬線粒體結構改變方面探討大鼠心臟驟停后，實施心肺復蘇術對大鼠海馬腦組織的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑動物呼吸機(ALC-V9型，北京吉安得爾)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，透射電鏡(日本 Hitachi公司)，生物機能實驗系統(BL-420F，成都泰盟科技)，全自動酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI 公司)，電泳和凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad 公司)。依達拉奉注射液(西安利君制藥，批號H20120042)，羊抗鼠Nrf2、羊抗鼠Keap1、兔抗鼠β-actin多隆抗體(美國Abcam公司，批號分別為ab137550、ab118285、ab10005)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成生物，批號分別為A003-1-2、A001-3-2)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，批號15596-018)，反轉錄試劑盒(北京聚美生物，批號RP1200)。

1.2 動物模型制備成年雄性SD大鼠40只，清潔級，體質量(290±20)g，購于安徽省動物實驗中心(皖動準201901號)，在通風透氣25 ℃環境溫度條件，白天黑夜各12 h交替，適應性飼養1周后進行分組實驗。SD大鼠隨機均分為對照組(10只)和模型組(30只)，大鼠CA/CPR模型制備采用窒息法，參照文獻[6]，將大鼠麻醉后，氣管插管，建立人工通氣，夾閉氣管插管使大鼠窒息，大鼠動脈血壓≤20 mmHg，心率消失時，模型組實施心臟驟停10 min；心肺復蘇組實施心臟驟停3 min后行心肺復蘇操作，包括人工大鼠胸外按壓，機械通氣等，使得大鼠動脈血壓≥60 mmHg，心率≥100 次/min，且血壓和心率逐漸平穩，證實心肺復蘇完成。對照組SD大鼠行麻醉、氣管插管等操作，但不實施氣管夾閉和心肺復蘇等操作。依達拉奉組在實施心臟驟停3 min后，靜脈注射依達拉奉注射液3 mg·kg-1，各組10 min后處死大鼠，每組取3只大鼠腦組織做蘇木素-伊紅(htoxylin eosin，HE)染色病理組織學評分，2只大鼠海馬組織電鏡觀察線粒體等結構改變，余下5只大鼠海馬組織置-80 ℃做后續實驗。

1.3 血清氧化應激指標檢測心肺復蘇實驗結束后，在大鼠處死前，每只大鼠抽取靜脈血5 mL置離心管中，5 000 r·min-1離心10 min后，分離血清，取上清液放置于-20 ℃冰箱待測。嚴格按照試劑盒操作說明書檢測大鼠血清反映氧化應激指標，應用硫代巴比妥酸法測定血清MDA 含量，羥胺法測定血清SOD活性，應用全自動酶標儀檢測532 nm處的吸光度值。

1.4 HE染色觀察大鼠海馬腦組織病理學檢查大鼠腦組織置10%福爾馬林溶液固定24 h，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，厚5 μm切片，HE染色，光鏡下尋找海馬部位，觀察其中神經元結構變化病理學改變。在×40物鏡下，每張切片隨機挑選3個視野，計數受損神經元占整個視野神經元百分比(%)。

1.5 電鏡觀察大鼠海馬結構準確選取約1×1×1 mm3各組大腦海馬腦組織，3%戊二醛溶液固定12 h，鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，丙酮透明，812樹脂包膜，超薄切片，電鏡觀察并攝片。電鏡下對線粒體超微結構觀察，了解海馬神經元線粒體膜、基質和嵴等結構改變。

1.6 實時熒光定量PCR觀察大鼠海馬實驗采取實時熒光定量PCR(real - time PCR)觀察大鼠海馬組織中Nrf2、Keap1 mRNA表達，取上述各組大鼠海馬腦組織，加入適量TRIzol，提取并測定總RNA濃度，cDNA反轉錄試劑盒逆轉錄，引物由上海生工公司合成，引物序列如下：Nrf2 mRNA 正鏈5′-CTCCTTAGACTCAAATCCCACCTT-3′，反鏈5′-GGACAGATCACAAGCCCTCAAT-3′，長度163 bp；Keap1 mRNA 正鏈5′-AACTCGGCAGAATGTTACTACCC-3′，反鏈5′-CTACGAAAGTCCAGGTCTCTGTCTC-3′，長度190 bp；內參照β-actin mRNA 正鏈5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，反鏈5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，長度239 bp。進行熒光RT-PCR，實驗結果用2-ΔΔCT相對定量法作統計學處理。

1.7 Western blot檢測大鼠海馬腦組織中Nrf2-Keap1表達將凍存的大鼠海馬組織取出后，適量蛋白裂解液組織勻漿，冷凍離心機10 000 r·min-1×10 min離心，取上清液并定量總蛋白。行SDS-PADGE凝膠電泳時上樣量為50 μg，電泳、轉膜、封閉，加入特異性一抗(Nrf2濃度1 ∶2 000，Keap1濃度1 ∶1 500，β-actin濃度1 ∶2 500)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后顯色。用ImageJ軟件進行灰度分析，結果以目的蛋白與β-actin相對表達量表示。

2 結果

2.1 各組大鼠血清氧化應激指標比較與對照組比較，模型組大鼠血清MDA含量顯著升高，SOD活性顯著下降，兩組比較差異有顯著性(P<0.01)；與模型組比較，心肺復蘇組和依達拉奉注射組大鼠血清MDA含量顯著下降，SOD活性顯著上升，兩組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。見Tab 1。

Tab 1 Effect of MDA content and SOD activity in serum of

2.2 大鼠海馬腦組織病理學變化海馬受損神經元的病理結構改變包括細胞質中Nissl 體減少，胞質空泡化和細胞核固縮。對照組大鼠海馬腦組織神經元細胞形態完整，細胞核位于中央，核仁清楚，胞質中充滿Nissl體。模型組海馬腦組織細胞輪廓不清，細胞質中Nissl體明顯減少，細胞水腫明顯，受損神經元較正常組明顯增多(P<0.01)。心臟驟停后心肺復蘇組和依達拉奉組海馬神經元形態稍不規則，部分神經元胞質中Nissl體消失，細胞間隙輕度增加，發現水腫較缺血組明顯好轉，進行受損神經元百分比計數，取平均值，受損神經元較缺血組明顯好轉(P<0.01)。見Fig 1。

Fig 1 Hippocampal pathological changes of rats in each group (HE×400)A: Normal group; B: Ischemia group; C: Cardiopulmonary resuscitation group; D: Edaravone Group; E: Statistical chart. Note: ##P<0.01 vs Normal group；**P<0.01 vs Ischemia group

2.3 電鏡觀察大鼠海馬超微結構電鏡下，對照組大鼠海馬神經元線粒體結構正常，可見明顯的線粒體膜和嵴狀突起；心臟驟停的缺血組大鼠海馬神經元線粒體損傷明顯，表現為線粒體體積增大、腫脹，膜和線粒體嵴斷裂，空泡狀；心肺復蘇組和依達拉奉組線粒體結構改善明顯，見Fig 2。

2.4 RT-PCR觀察大鼠海馬Nrf2、Keap1 mRNA表達采用RT-PCR法觀察各組大鼠海馬組織中Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA和β-actin mRNA的表達情況，結果見Fig 3所示。抗氧化調控因子Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA的檢測發現，與對照組比較，模型組Nrf2 mRNA/β-actin mRNA、Keap1mRNA/β-actin mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，心肺復蘇組和依達拉奉組Nrf2 mRNA/β-actin mRNA、Keap1 mRNA/β-actin mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。提示心臟驟停后，心肺復蘇過程中氧化應激可能是通過上調抗氧化基Nrf2 mRNA的表達，下調Keap1 mRNA表達。

Fig 2 Ultrastructural changes of hippocampal pathology in each group (EM×2 400)A: Control group; B: Ischemia group; C: Cardiopulmonary resuscitation group; D: Edaravone Group

Fig 3 Relative expression levels of hippocampal Nrf2 and Keap1 genes in rats n=3)*P<0.05 vs Ischemia group; ##P<0.01 vs Control group

2.5 大鼠海馬腦組織中Nrf2-Keap1蛋白表達采用Western blot法觀察各組大鼠海馬組織中氧化應激蛋白Nrf2和Keap1的表達情況，結果見Fig 4所示。與對照組大鼠比較，模型組大鼠海馬中Nrf2/β-actin、Keap1/β-actin蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，心肺復蘇組和依達拉奉組Nrf2/β-actin、Keap1/β-actin 蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。

Fig 4 Relative expression levels of hippocampal Nrf2 and Keap1 protein in ratsA: Typical protein expression, B: Statistical n=3)； ##P<0.01 vs Control group, *P<0.05 vs Ischemia group

3 討論

決定心跳驟停后患者行心肺復蘇過程效果的重要因素之一是腦復蘇，但其療效有限，是全球性難以解決的問題。統計數據表明，美國院外每年約有30萬心跳驟停患者，超過半數患者出現死亡，主要是由于患者神經系統出現不可逆性受損[6]。CPR后，患者全身器官存在缺血/再灌注損傷，而大腦對缺血缺氧較為敏感，而且腦組織中海馬與學習記憶有關，與患者預后關系密切[7]。故本研究重點觀察心跳驟停后大鼠行心肺復蘇的海馬結構變化，研究表明，模型組海馬中損傷的神經元明顯增多，細胞質中Nissl 體減少，表明神經遞質合成減少；而心臟驟停后心肺復蘇組受損神經元數目較缺血模型組明顯減少，神經元胞質中Nissl體含量明顯增多，心跳驟停后及時體外按壓，促使心肺復蘇，可以促進大鼠自主循環重新建立，恢復全身組織器官，尤其是腦組織的供血供氧，故早期進行心肺復蘇有利于神經系統功能恢復。在缺血/再灌注的應激反應過程中，機體產生大量氧自由基，依達拉奉也有一定的清除氧自由基功能，減輕神經細胞凋亡，從而降低氧化應激反應，且有報道顯示，依達拉奉能夠增加缺血腦組織中神經生長因子，降低腦損傷[8]，故本研究將其選為陽性對照藥。

臨床上，如何降低CPR 后腦損傷，改善患者生存質量。缺血/再灌注引起機體氧自由基(ROS)增多，ROS具有強氧化作用，化學性質活潑，引起細胞膜和細胞器膜骨架成分改變，造成細胞結構受損。ROS促使脂質過氧化反應而破壞膜結構和功能，導致膜通透性升高，細胞膜上Na+/Ca2+交換功能紊亂，引起細胞內Ca2+超載，激活磷脂酶類，破壞細胞器膜結構，加重細胞腫脹[9]。線粒體是細胞內氧化磷酸化供能的細胞器，是反映細胞內缺氧損傷的中心結構；腦缺血缺氧時，線粒體氧化磷酸化的代謝底物氧、糖等衰竭，神經元膜電位難以維持，電壓依賴性鈣通道開放，細胞鈣離子內流導致鈣超載，同時，線粒體為機體產生內源性活性氧的主要部位，鈣超載等降低線粒體電子傳遞鏈，引起ROS增多，破壞線粒體膜磷脂，使細胞能量代謝進一步出現障礙[10]。本研究通過檢測大鼠血清氧化應激指標，發現心跳驟停大鼠存在氧化應激情況，表現為血清MDA升高，SOD活性下降，而心肺復蘇后，大鼠血清MDA含量下降，SOD活性上升，表明心肺復蘇降低了大鼠心跳驟停后氧化應激損傷。同時，本研究通過透射電鏡也證實了海馬神經元中線粒體參與該損傷修復過程，表現為心臟驟停的缺血大鼠海馬神經元線粒體損傷明顯，線粒體嵴斷裂，空泡狀，而心肺復蘇后線粒體結構改善明顯。

鋅指蛋白轉錄因子家族成員Nrf2可調控抗氧化反應原件，Keap1是Nrf2胞質蛋白伴侶分子，Nrf2是機體細胞抗氧化損傷的關鍵因子，正常情況下，Nrf2可修復細胞損傷，Nrf2與Keap1以二聚體形式存在于細胞質中，并達到相對平衡狀態；在氧化應激損傷等刺激后，Nrf2與Keap1解離，激活下游抗氧化反應，提高細胞抗氧化應激功能[11]。心臟驟停產生的應激對機體組織細胞形成極強的刺激，促進呼吸爆發活性，激活氧化信號通路Nrf2-Keap1中相關基因的活性。本研究表明，通過檢測大鼠海馬組織中與抗氧化相關基因的Nrf2 mRNA和Keap1 mRNA表達，以及進一步在蛋白水平上進行Nrf2、Keap1檢測，均得到一致的結果，證實心臟驟停后，實施心肺復蘇對大鼠海馬腦組織Nrf2、Keap1 蛋白表達降低，緩解氧化應激損傷。

綜上，心臟驟停后，大鼠機體會出現氧化應激損傷，表現為海馬腦組織損傷，線粒體結構出現較為嚴重的破壞，心肺復蘇可部分逆轉該破壞，其機制與降低氧化應激損傷Nrf2/Keap1蛋白等有關。

(本研究在安徽醫科大學人體形態實驗中心完成，感謝給予幫助的老師和同學們)