具棲冬青苷對大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷的保護作用研究

楊愛萍，張啟春，宋 祎，楊 夢，王君陽，王 暢，胡立宏，王嚇長

(南京中醫藥大學江蘇省中藥功效物質重點實驗室，江蘇 南京 210023)

急性心肌梗死作為臨床上較常見的急危重癥，是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧引起心肌壞死的一類疾病，具有發病快，致死致殘率高等特點[1, 2]。隨著溶栓療法以及心外科技術的進步，急性心肌梗死患者的死亡率在逐漸減低，但缺血/再灌注后中斷的血流突然恢復，隨之產生的一系列如再灌注心律失常、微循環障礙、心肌頓挫以及部分心肌細胞損傷進行性加重等不良反應仍然給患者帶來嚴重的傷害[3-6]。心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)作為心血管疾病近年來研究的熱點之一，尋找藥物預處理來對抗MIRI是目前臨床工作中亟待解決的問題。

救必應為我國南方常用中藥，始載于《嶺南采藥錄》，為冬青科植物鐵冬青(IlexrotundaThunb.)的干燥樹皮或根皮。早期文獻報道，救必應提取物具有降低血壓，減慢心率，緩解心絞痛，預防冠心病，抗缺氧，抗心律失常以及抵抗心肌缺血的作用[7-8]。具棲冬青苷(pedunculoside，PE)為救必應的活性成分之一[9-10]，結構式見Fig 1，其對MIRI的治療作用目前未見報道。本實驗通過結扎大鼠心臟冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary，LAD)30 min，再灌注24 h的方法建立大鼠MIRI模型，研究具棲冬青苷預處理對MIRI的保護作用，并探討其可能的機制，為臨床尋找更好的心肌保護藥物提供參考。

Fig 1 Chemical structure of pedunculoside (PE)

1 材料

1.1 實驗動物健康成年SD大鼠，SPF級，♂，體質量(300±30) g，由江蘇省南京市青龍山實驗動物養殖場提供，動物許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，合格證號：20180004025638。

1.2 藥物和試劑具棲冬青苷(實驗室自制，純度99.5%，白色粉末，易溶于甲醇和DMSO，可溶于水，常溫保存)；卡托普利片(批號20180306，中美上海施貴寶制藥有限公司)；酒石酸美托洛爾片(批號20171208，阿斯利康制藥有限公司)；戊巴比妥鈉(批號20161202，上海市惠興生化試劑有限公司)；肝素鈉(批號421F027，南京森貝伽生物科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，批號20160901，南京森貝伽生物科技有限公司)；伊文思藍(批號20170305，南京森貝伽生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MAD)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，CTnI)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，批號20200801。

陽性對照藥美托洛爾、卡托普利和受試藥物具棲冬青苷均采用0.5%羧甲基纖維素鈉配制的混懸液進行灌胃給藥，藥物當天配制，現配現用。

1.3 主要儀器設備小動物呼吸機(型號AE02-ALC-V8S，上海奧爾科特生物科技有限公司)；Power Lab(型號PL3508B73，上海贊德醫療器械有限公司)；酶標儀(型號M200 Pro Nanoquant，上海帝肯貿易有限公司)；冷凍離心機(批號Auegra X30R，Beckman公司)；電子天平(型號OHAUS，蘇州塞恩斯儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組及處理SD大鼠購入后在室溫23 ℃-26 ℃，相對濕度40%-60%環境下飼養7 d，期間自由進食飲水。術前選取體質量在(300±30) g的大鼠，隨機分成7組，即假手術組(Sham)、急性心肌缺血/再灌注損傷模型組(M)、卡托普利組(Capt，12.5 mg·kg-1，陽性藥)、美托洛爾組(MT，15 mg·kg-1，陽性藥)、PE低、中、高劑量組(2.5、5和10 mg)，每組大鼠10只。

2.2 實驗模型的制備大鼠稱重，用2%戊巴比妥鈉溶液(60 mg·kg-1)行腹腔注射麻醉，觀察大鼠反應，待角膜反射、肌張力消失后，置鼠板仰臥位固定。剪去大鼠頸部正中、左前胸的體毛備皮，碘伏消毒。先實施頸部開口，暴露氣管，于視覺可見下連接小動物呼吸機，設置呼吸頻率為90次/min，潮氣量為3 mL/100 g，觀察2 min。待大鼠呼吸平穩后，打開Powerlab，將針式電極固定于大鼠四肢皮下, 以監測肢體Ⅱ導聯心電圖的變化。并于左胸前第3-4肋間逐層開胸，分離心包，暴露心臟，于肺動脈圓錐和左心耳間找到左冠狀動脈前降支LAD，用絲線于左心耳下緣2 mm處以活結結扎，附帶結扎自制導管。以Ⅱ導聯心電圖采集的圖像中ST段明顯抬高，結扎點以下部位心肌色澤瞬時變蒼白，或發生區域性心肌運動障礙，即為LAD結扎成功的標志[11-14]。結扎30 min后，打開活結，去掉自制導管，恢復血液供應，實現血液再灌注。隨后，立即用棉球小心拭去胸腔積水，輕輕調整心肺正常位置，逐層縫合傷口，縫合時胸腔預留自制抽氣導管，待拉緊縫合線關閉胸腔后，抽氣并拔出導管以恢復胸腔的負壓狀態。整個再灌注過程持續24 h，24 h后進行各指標檢測。假手術組大鼠同模型組大鼠手術過程，但僅在LAD下留置絲線，不進行結扎和再灌注手術。術后觀察大鼠心電圖，如無心律失常、室顫等異形波形圖，且呼吸平穩，可小心去掉呼吸機，縫合頸部皮膚。將大鼠置寵物電熱毯保暖至麻醉消退意識恢復。

2.3 給藥方法大鼠術前3 d連續灌胃給藥，每日1次，每次灌胃以當天體重計算，灌胃體積10 mL·kg-1。模型組、假手術組給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。其余各組分別給予PE低、中、高劑量(2.5、5和10 mg·kg-1)、陽性對照藥卡托普利12.5 mg·kg-1、陽性對照藥美托洛爾15 mg·kg-1。末次給藥2 h后開始急性心肌缺血/再灌注損傷手術操作。

2.4 指標檢測

2.4.1Ⅱ導聯心電圖 記錄各組大鼠的Ⅱ導聯心電圖，觀察缺血性心律失常的發生，并記錄缺血/再灌注后ST段高度的變化。

2.4.2血流動力學 連接生物信號采集系統Power Lab、壓力換能器及聚乙烯導管，用0.1%肝素鈉生理鹽水沖洗并充盈導管，排空氣泡備用。分離大鼠右頸總動脈，根據顯示器所示壓力圖形的變化，將含0.1%肝素鈉的導管緩緩插入左心室，監測大鼠左心室血流動力學的變化，評估心臟收縮及舒張功能。觀察指標包括左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室等容期壓力最大變化速率(the maximum rate of pressure rise and fall，±dP/dtmax)。

2.4.3心肌梗死面積 待再灌注結束后，將2 mL 1%伊文思藍由主動脈注入左心室染色，區分非缺血區(藍染區)與缺血區(非藍染區)。然后迅速處死大鼠，取出離體心臟，用冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，擠出心臟內部液體，濾紙吸干心臟表面水分，稱量心臟重量，用于心臟臟器指數計算。置-80 ℃冰箱冷凍10 min后取出，將心臟橫切成2 mm厚的切片，置于1% TTC溶液中，37 ℃恒溫避光染色20 min，區分缺血未梗死區(磚紅色)和梗死區(灰白色)。TTC染色后將心肌切片放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。心肌切片拍照后，采用電腦圖像分析軟件Image Pro Plus測定心肌梗死面積百分比/%=(心肌梗死區面積之和/心肌缺血區面積之和)× 100%。

2.4.4心臟臟器指數 心臟臟器系數=(心臟重量/體重)× 100%，體重為末次給藥體重。

2.4.5血清中SOD、MAD、CTnI含量測定 測定血流動力學后，大鼠頸動脈取血4 mL，4 ℃靜置1 h，以3 500 r·min-1低溫離心10 min，分裝血清于EP管中，-80 ℃保存。測定時取出血清，快速解凍，嚴格按照試劑盒說明，測血清中SOD、MAD和CTnI的含量。

3 結果

3.1 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠心電圖ST段高度的影響SD大鼠在結扎LAD后，可見S波消失，ST段明顯抬高，經血液再灌注24 h后，ST段略降低，但各組間未見顯著性差異，見Fig 2。MIRI模型制備過程中有5只大鼠因心律失常死亡而舍棄，建模成功率大于90%。

Fig 4 TTC staining of myocardial sections in rats

Fig 3 Evens blue staining of whole heart in rats

Fig 2 Changes of electrocardiogram of MIRI model ratsA： Normal electrocardiogram; B： After LAD ligation; C： 24 h after reperfusion

3.2 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠血流動力學的影響與假手術組比較，MIRI組大鼠LVSP和+dP/dtmax下降，LVEDP和-dP/dtmax上升，差異均有顯著性(P<0.01)，說明模型組大鼠心臟舒張功能和收縮功能明顯受損；與模型組比較，卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷中、高劑量組LVSP升高；卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷高劑量組+dP/dtmax升高；卡托普利組、具棲冬青苷高劑量預處理組LVEDP和-dP/dtmax降低，差異存在顯著性(P<0.05)；提示具棲冬青苷預處理有改善急性心肌缺血/再灌注損傷后心肌收縮及舒張功能的作用，結果如Tab 1所示。

Tab 1 Effects of pedunculoside on hemodynamics in MIRI rats

3.3 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠心肌梗死面積的影響各組大鼠經LAD結扎30 min，再灌注24 h后，整體心臟用伊文思藍染色后，除假手術組外，其他各組大鼠結扎線以下可見缺血區(非藍染區)，其中模型組缺血區域比較明顯，見Fig 3。心肌切片用TTC染色后，同樣模型組梗死區(灰白色區)較明顯，見Fig 4。

與假手術組相比，心肌缺血/再灌注模型組大鼠心肌梗死面積明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷低、中、高劑量組心肌梗死面積明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且具棲冬青苷高劑量組的效果比低劑量的效果更明顯，提示具棲冬青苷預處理可緩解心肌缺血/再灌注后的心肌梗死，見Fig 5。

Fig 5 Effects of pedunculoside on myocardial infarct size in MIRI rats*P<0.05，**P<0.01 vs MIRI Model; ##P<0.01 vs Sham operation.

3.4 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠心臟臟器指數的影響模型組大鼠心臟臟器指數相對假手術組明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷中、高劑量組MIRI大鼠心臟臟器指數降低，差異有顯著性(P<0.05)，提示具棲冬青苷預處理能有效減輕心肌缺血/再灌注損傷后的心臟組織炎性水腫。見Fig 6。

Fig 6 Effects of pedunculoside on HW/BW ratio in MIRI rats#P<0.05 vs Sham operation; *P<0.05 vs MIRI Model.

3.5 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠生化指標的影響與假手術組相比較，模型組血清SOD活性降低，差異有顯著性(P<0.01)；同時，MDA、CTnI水平增高，差異亦有顯著性(P<0.05)，說明模型制備成功。與模型組相比，卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷中、高劑量組大鼠血清SOD活性明顯提高，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷低、中、高劑量組大鼠血清MDA含量均降低，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)；CTnI含量卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷高劑量組明顯提高，差異有顯著性(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Effects of pedunculoside on level of SOD, MDA and CTnI in MIRI rats n=10)

4 討論

心肌缺血/再灌注損傷的發生是一個復雜的病理生理過程，嚴重者可導致心律失常、心肌頓挫、微血管受損及不可逆的細胞壞死和凋亡等。造成急性心肌缺血后再灌注損傷的機制主要包括微循環障礙、炎癥作用、心肌間質水腫、鈣超載、白細胞侵入以及酸中毒等方面[15-16]。心肌缺血/再灌注損傷程度與心臟左室功能密切相關，血流動力學指標LVSP、LVEDP、±dP/dtmax是反應心臟收縮和舒張功能的重要指標。定量組織學方法測定心肌梗死面積是心肌缺血研究最直觀的評價指標。SOD、MDA、CTnI是心肌損傷的標志物[17]。心肌細胞受損、細胞膜完整性破壞后，心肌酶等便會外漏釋放入血，臨床常以此診斷心肌損傷程度。SOD是機體內一種重要的抗氧化酶，MIRI時，SOD活性降低，導致氧自由基大量堆積，從而造成心肌損傷，使血清CTnI含量升高，同時，脂質過氧化產物MDA含量升高。基于中藥救必應前期在心血管疾病治療作用方面的研究報道，開展其主要活性成分具棲冬青苷抗MIRI藥效學研究，為臨床尋找更好的心肌保護藥物提供參考。

本實驗根據急性心肌缺血/再灌注損傷疾病的特點，通過結扎LAD 30 min，再灌注24 h制備大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷模型，選擇臨床一線治療藥物β-受體阻滯劑美托洛爾與血管緊張素轉化酶抑制劑卡托普利作為動物實驗的陽性對照藥，從心電圖、血流動力學、心肌梗死面積、心臟臟器指數、血清生化指標等方面探討具棲冬青苷的心肌保護作用。結果表明，與MIRI模型組比較，具棲冬青苷預處理組①心電圖ST段高度明顯降低，提示具棲冬青苷預處理可緩解心肌缺血及再灌注后心肌組織損傷；②血流動力學指標明顯改善，表現為LVSP和+dP/dtmax升高，LVEDP和-dP/dtmax降低，提示具棲冬青苷預處理對MIRI大鼠左室收縮和舒張功能有保護作用；③心肌梗死面積明顯下降，提示具棲冬青苷可減少心肌細胞持續壞死；④心臟臟器指數降低，提示具棲冬青苷可減少缺血/再灌注后心肌組織的炎性水腫，降低炎癥反應；⑤反應心肌損傷程度的CTnI水平降低，SOD活性升高，心肌組織過氧化產物MDA含量降低，提示具棲冬青苷預處理可降低心肌細胞損傷，且在眾多指標的改善上并不弱于陽性藥卡托普利和美托洛爾。綜上可見，具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注損傷有明顯的保護作用。這種保護作用可能與具棲冬青苷預處理增強SOD清除氧自由基能力，降低過氧化物MDA的生成，抑制心肌細胞凋亡，抵抗缺血/再灌注損傷后的心肌細胞持續性壞死，保護保護心臟功能相關；其詳細作用機制有待進一步研究。