雙環醇通過抑制線粒體凋亡途徑緩解TNF-α/D-GalN誘導的爆發性肝損傷

李 虎，李健蕊，劉楠楠，汪美汐，譚佳麗，彭宗根

(中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所，北京 100050)

急性肝損傷是由各種原因引起的肝臟短時間內功能異常，嚴重者甚至導致肝衰竭，進而危及生命[1]。急性肝損傷可由肝臟長時間缺血、藥物、乙醇、毒素或毒物暴露、代謝紊亂、感染及免疫過程等引起。由于病因多樣且發病較急，目前對其治療仍是一個挑戰[1]。急性肝損傷發病機制復雜，涉及氧化應激、炎癥反應、NF-κB活化、細胞凋亡等[2]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)作為一種多效性細胞因子，在各種肝病中大多可見含量升高，其誘導的細胞凋亡是肝損傷的一種典型的病理機制[3]。TNF-α聯合應用肝臟特異性致敏劑D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)可誘導肝細胞凋亡和肝組織損傷，目前已在多種體內外模型中證明了其誘發急性肝損傷的作用[4-6]。

雙環醇(Bicyclol)是由我國自主研發的I類抗炎保肝藥物[7]。在刀豆蛋白A、順鉑、四環素、酒精及肝臟缺血/再灌注等引起的小鼠或大鼠肝損傷模型中已證實具有明顯的肝保護作用[7-8]。其中，雙環醇對化學性肝損傷的作用與保護線粒體功能，清除自由基，調節脂質代謝等有關[7-8]；而對刀豆蛋白A等引起的免疫性肝損傷的保護作用與調節炎癥/抗炎因子的體內平衡、調節內質網功能及促進熱休克蛋白的表達，從而抑制肝細胞凋亡有關[7-8]。另外，雙環醇對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/D-GalN及聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，Poly(I:C))/D-GalN引起的肝損傷同樣具有明顯緩解作用，其機制則涉及抗炎、抗氧化應激作用[9-11]。鑒于TNF-α/D-GalN誘導的細胞凋亡在肝損傷中的關鍵作用，雙環醇對TNF-α/D-GalN誘導的凋亡性肝損傷是否同樣具有保護作用，目前尚未可知。本研究擬通過TNF-α聯合D-GalN(TNF-α/D-GalN)誘導的小鼠急性凋亡性肝損傷模型，評價雙環醇對肝損傷的保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑雙環醇(北京協和藥廠，純度> 99%)，小鼠TNF-α重組蛋白(R&D Systems)，D-GalN(Sigma)。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Roche)，線粒體提取試劑盒(索萊寶)。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)、caspase-9活性檢測試劑盒及Bradford蛋白定量試劑盒(碧云天)。純化線粒體膜通道孔(mPTP)光度法檢測試劑盒(美國GENMED公司)。細胞色素C(Cytochrome c, Cyt c)及Actin抗體(Cell Signaling公司)。激活型caspase-3及caspase-9、Bax、Bcl-2、COX IV抗體(沈陽萬類生物公司)。

1.2 模型及處理SPF級♂ C57BL/6N小鼠(22.0 g±2.0 g)購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號SCXK(京)-2019-0010。小鼠適應3 d后按體質量隨機分成6組：對照組、雙環醇高劑量(200 mg·kg-1·d-1)單獨處理組、模型組、模型+雙環醇低/中/高劑量(50/100/200 mg·kg-1·d-1)組，每組6只。采用不同劑量雙環醇或對照溶劑(5 g·L-1的羧甲基纖維素鈉)灌胃5 d，每天2次。于末次給藥后2 h腹腔注射700 mg·kg-1的D-GalN，30 min后腹腔注射10 μg·kg-1的TNF-α，正常及雙環醇單獨給藥組給予溶劑PBS腹腔注射。4 h后取血并分離血清，生化儀檢測ALT和AST，收集肝組織標本用于后續檢測。實驗按照國家實驗室動物飼養管理規范進行，并經中國醫學科學院醫藥生物技術研究所倫理委員會審核批準。

1.3 生存率分析將60只SPF級♂ C57BL/6N小鼠(22.0 g±2.0 g)按體質量隨機分成對照組、模型組、模型+雙環醇低劑量組、模型+雙環醇高劑量組，每組15只。給藥及誘導過程同上，于TNF-α注射后觀察并記錄各組小鼠24 h生存情況并繪制生存率曲線。

1.4 組織病理及TUNEL細胞凋亡檢測采集小鼠肝右葉相同部位肝組織，10%中性福爾馬林固定24 h后，常規程序制作蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色玻片，顯微鏡下觀察各組肝組織病理學改變。TUNEL細胞凋亡檢測采用肝組織經4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片，常規脫蠟、蒸餾水洗。加入蛋白酶K 37℃孵育30 min，PBS洗3次。吸干周圍水分，加入TUNEL反應混合液37 ℃孵育2 h，PBS洗3次。用新配制的3%過氧化氫溶液室溫避光孵育15 min，PBS洗3次。加入適量converter-POD覆蓋組織，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次。DAB顯色，蘇木精復染、脫水、封片后顯微鏡觀察，陽性細胞的胞核呈棕黃色。

1.5 caspase活性檢測按照說明書方法研磨各組小鼠肝組織，Bradford法測定肝勻漿蛋白含量，調整蛋白濃度一致。取96孔板，設立空白對照孔、樣品孔及不同濃度標準品孔，配制反應體系及加樣。405 nm波長下測定OD值，以對照組caspase活性為1，計算各組caspase-3及-9相對活性。

1.6 純化線粒體膜通透性轉換孔(membrane permeability transition pore, mPTP)開放狀態測定用線粒體提取試劑盒提取肝組織線粒體并定量。根據說明書，取200 μg純化線粒體加入到96孔板對應孔中，然后加入170 μL室溫預熱的緩沖液，混勻后即刻放入酶標儀測定540 nm波長下初始讀數(OD0 min)。室溫靜置1 min，加入10 μL誘導液，混勻后測定10 min吸光度值OD10 min，計算吸光值降低相對大小Relative△A540=(OD0 min-OD10 min)/ OD0 min。吸光值降低越大(比值越大)，表明線粒體mPTP開放程度越大。

1.7Westernblot取肝組織按質量比例加入裂解液，勻漿器研磨后12 000×g，4 ℃離心10 min。取上清進行蛋白定量，調整濃度一致，加入上樣緩沖液并煮沸后用于Western blot檢測。常規上樣、電泳、轉膜、封閉后于4 ℃孵育一抗Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2、Cyt c過夜(1:500)。次日，TBST洗3次，室溫孵育相應二抗(1 ∶5 000)1 h，使用Bio-Rad凝膠成像系統檢測蛋白條帶，采用Gel-Pro analyzer進行定量分析。Cyt c及內參COX Ⅳ蛋白檢測采用線粒體提取試劑盒提取線粒體并裂解、煮沸后上樣檢測。

2 結果

2.1 雙環醇提高TNF-α/D-GalN誘導肝損傷小鼠的生存率如Fig 1所示，TNF-α/D-GalN處理后小鼠陸續死亡。6 h時，模型組生存率為60%，雙環醇低、高劑量組均為100%；8 h時，模型組生存率為6.67%，雙環醇低、高劑量組均分別為46.67%及53.33%；12 h及24 h時，模型組生存率為0%，雙環醇低、高劑量組均分別為20%及33.33%。因此，雙環醇低、高劑量干預后小鼠生存率較模型組有明顯提升，兩組生存率的提高均有統計學意義(P<0.01)。

2.2 雙環醇緩解TNF-α/D-GalN導致的凋亡性肝損傷轉氨酶是反映肝臟功能的常用指標。本研究中，雙環醇單獨處理對轉氨酶水平無影響，而雙環醇干預能明顯抑制TNF-α/D-GalN誘導的ALT及AST升高(Fig 2A和2B)。肝臟大體觀察可見模型組肝臟出血灶明顯，給藥后明顯好轉(Fig 2C)。病理結果與以往TNF-α/D-GalN誘導肝損傷病理損傷相似[6]，模型組可見大量肝細胞死亡并伴有出血淤積、大片肝索結構破壞，而不同劑量雙環醇干預后，肝小葉內結構破壞及紅細胞淤積情況均明顯減輕(Fig 2C)。TUNEL法肝組織內細胞凋亡檢測結果顯示：肝臟凋亡細胞核染成棕黃色，模型組凋亡細胞數目較多，雙環醇干預后肝細胞凋亡明顯減少(Fig 2C)。因此，雙環醇能夠減輕TNF-α/D-GalN誘導的肝組織損傷及肝細胞凋亡，且對細胞凋亡的抑制具有一定的劑量依賴性。

Fig 1 Effect of bicyclol on mouse survival rate of TNF-α/D-GalN-induced fulminant **P<0.01 vs TNF-α/D-GalN-induced model group

2.3 雙環醇抑制TNF-α/D-GalN誘導的線粒體凋亡途徑caspase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，介導細胞凋亡的級聯反應，是細胞凋亡的中心調節分子。各組小鼠在PBS或TNF-α/D-GalN腹腔注射后4 h取肝組織，勻漿后檢測肝內caspase-3和caspase-9(caspase-3/-9)活性。結果顯示：雙環醇單獨給藥組與正常對照組相比較，caspase-3/-9活性無顯著變化，而模型組兩者活性明顯高于對照組。與模型組相比較，不同劑量雙環醇干預后caspase-3/-9的活性顯著降低(Fig 3A和3B)。與此一致，Western blot結果也證實模型組小鼠肝內激活型caspase-3/-9蛋白水平較正常對照組明顯升高，而雙環醇干預后肝內激活型caspase-3/-9蛋白水平明顯下調(Fig 3C)。同時，不同劑量雙環醇可降低TNF-α/D-GalN引起的Bax升高，并一定程度逆轉TNF-α/D-GalN引起的抗凋亡蛋白Bcl-2下調。因此，TNF-α可引起D-GalN致敏的小鼠線粒體凋亡途徑激活，而雙環醇可明顯抑制該過程，從而發揮抗肝損傷作用。

Fig 2 Effect of bicyclol on TNF-α/D-GalN-induced apoptotic liver injury in **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs TNF-α/D-GalN-induced model group

Fig 3 Effect of bicyclol on mitochondrial apoptosis pathway of TNF-α/D-GalN-induced fulminant hepatitis in *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TNF-α/D-GalN-induced model group

2.4 雙環醇的抗凋亡效應與線粒體保護作用有關線粒體為TNF-α/D-GalN誘導肝細胞凋亡機制的核心環節，線粒體細胞色素C的胞質釋放引起下游caspase的激活。因此，我們檢測了雙環醇在該模型中是否對線粒體起到保護作用。結果顯示，雙環醇單獨給藥對線粒體及胞質細胞色素C含量無影響，但可降低TNF-α/D-GalN誘導的胞質細胞色素C含量增加，抑制線粒體內細胞色素C含量的減少，即雙環醇抑制了TNF-α/D-GalN引起的線粒體內細胞色素C的胞質釋放，且該效應具有一定的濃度依賴性(Fig 4A)。肝損傷過程中線粒體mPTP的開放引起細胞色素C的胞質釋放，mPTP開放程度檢測結果顯示：雙環醇處理后吸光度降低較模型組小，說明其可抑制TNF-α/D-GalN誘導的mPTP開放增強(Fig 4B)。因此，雙環醇在TNF-α/D-GalN誘導的肝損傷模型中的抗凋亡效應與其保護線粒體膜通透性，進而抑制線粒體內細胞色素C的胞質釋放有關。

Fig 4 Effect of bicyclol on cytochrome c level and opening of membrane permeability transition pore in mouse liver *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TNF-α/D-GalN-induced model group

3 討論

腹腔聯合注射TNF-α和特異性肝臟致敏劑D-GalN可誘導肝細胞凋亡。目前，多種體內外模型已證實其在誘導急性肝細胞凋亡性肝損傷中的作用[4-6,12]。細胞凋亡是TNF-α/D-GalN誘導重型肝炎的主要機制，抑制凋亡過程有望使肝損傷得到較好的治療。雙環醇作為我國臨床推薦的常用保肝抗炎藥物，在化學性、免疫性、脂肪性、肝部分切除與缺血再灌注等肝功能損傷模型中具有良好的抗炎保肝作用[8,13]。前期我們在Poly(I:C)/D-GalN誘導的肝炎中證明了雙環醇對氧化應激及炎癥通路的抑制與其對線粒體的保護作用有關，但該機制并未涉及細胞凋亡過程[11]。因此，我們進一步提出假設：雙環醇或可通過對線粒體的保護抑制TNF-α/D-GalN誘導的凋亡性肝損傷。本研究中我們證實了雙環醇通過抑制經典的線粒體凋亡途徑，緩解TNF-α/D-GalN誘導的肝損傷。

爆發性肝損傷病情進展迅速，往往對生命造成重大威脅。本研究中TNF-α/D-GalN誘導小鼠后6 h即可引起小鼠死亡，至12 h時模型組死亡率為100%，而雙環醇處理可延緩小鼠死亡，明顯提高生存率。TNF-α可通過兩條途徑誘導細胞凋亡[14]，一種是內源性凋亡信號途徑，即線粒體損傷引起細胞色素C的胞質釋放及caspase-3和caspase-9激活，進而誘導下游凋亡級聯反應。該過程中，mPTP作為跨越線粒體內外膜的由多種蛋白質組成的復合蛋白通道，其開放程度決定了凋亡因子細胞色素C等的胞質釋放程度，基質中的促凋亡蛋白Bax、Bak等可增加其通透性，而抗凋亡的Bcl-2、Bcl-xL等蛋白則抑制這一過程[15-16]。本研究中我們發現，雙環醇可抑制線粒體凋亡途徑中caspase-3和caspase-9的激活。進一步研究顯示，雙環醇抑制了促凋亡蛋白Bax并提高抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，進而降低了TNF-α/D-GalN誘導的mPTP開放程度，最終抑制了線粒體細胞色素C的胞質釋放。雙環醇在該模型中對線粒體膜通透性的保護與以往研究中其誘導熱休克蛋白進而維持細胞氧化還原穩態及線粒體穩定性的作用一致[7-8]。細胞凋亡的另一條途徑是外源性途徑：TNF-α與細胞表面TNF-α受體1(TNFR1)結合，進而通過接頭蛋白招募并激活caspase-8。激活的caspase-8不僅可以直接剪切并激活caspase-3，還可以通過剪切促凋亡蛋白Bid，促進其轉位到線粒體中激活Bax及Bak，從而進一步激活內源性凋亡途徑[17]。外源和內源途徑介導的細胞凋亡交織在一起，雙環醇抑制caspase-3的激活，這提示外源性凋亡途徑可能也被雙環醇所抑制。細胞凋亡通路失調與肝細胞癌、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎及各種類型肝損傷有直接聯系[3]，而文獻報道雙環醇對以上幾種肝病均有不同程度的保護作用。因此，基于本研究的結論，我們推測雙環醇對細胞凋亡的抑制或在各種病因引起的肝病中具有不同程度的作用。

綜上所述，雙環醇通過抑制TNF-α/D-GalN誘導的線粒體凋亡途徑緩解爆發性肝損傷，其機制與抑制線粒體膜通道轉換孔開放、減少線粒體內細胞色素C釋放進而抑制凋亡級聯反應通路有關。本研究補充了雙環醇對肝損傷過程中細胞凋亡的影響，為其在急性肝損傷防治中的更廣泛應用提供了參考。

(致謝：本研究在中國醫學科學院醫藥生物技術研究所動物實驗室和病毒室完成，感謝在實驗的指導老師及各位參與者！)