NLRP3炎性小體與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展

黃芷棋，寧一博，賀潤鋮，孫建寧，董世芬

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 102488)

糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病的首要致死原因，病變部位包括大血管和微血管，由微血管彌漫性損傷造成的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是當前的熱點研究之一。糖尿病性心肌病是1972年由Rubler等[1]首次提出。作為糖尿病特異心臟并發(fā)癥，DCM可獨立于冠狀動脈疾病、高血壓或瓣膜性心臟病發(fā)生心肌功能障礙，并與糖尿病患者的心力衰竭高發(fā)生率和高死亡率密切相關(guān)。

DCM早期臨床癥狀不明顯，與其它糖尿病并發(fā)癥相比研究相對滯后，確切的發(fā)病規(guī)律至今尚未完全闡明，也尚無公認的診療方法。疾病早期，高胰島素血癥、胰島素抵抗、游離脂肪酸和外周血循環(huán)瘦素水平增高以及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活即可誘導左心室肥厚發(fā)生[2]，表現(xiàn)為心肌細胞結(jié)構(gòu)改變、左心室容積、室壁厚度和緊張性、左心室重量等增加；隨著甘油三酯堆積和Ca2+轉(zhuǎn)運缺陷，成纖維細胞增殖以替代死亡的心肌細胞，并由轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)介導心肌細胞的纖維化[3]，導致左心室舒張功能下降，并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐詳U張型心臟重塑為特點的收縮功能障礙，進一步可能發(fā)展成為缺血性心臟病和心衰[4]。

目前公認的發(fā)病機制包括高血糖、蛋白非酶糖基化、氧化應激、心肌纖維化、鈣離子轉(zhuǎn)運異常、脂肪酸氧化增加以及神經(jīng)內(nèi)分泌功能激活等[5]。有研究指出，炎癥是糖尿病患者左室舒張功能障礙的獨立相關(guān)因素[6]。近年發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體在機體炎癥反應中起著重要作用，NLRP3炎性小體可通過促進DCM心臟炎癥，從而影響心臟功能。本文綜述NLRP3炎性小體在DCM發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以為深入闡釋該疾病的病理進程以及相關(guān)藥物的開發(fā)提供借鑒。

1 NLRP3炎性小體及其激活機制

炎性小體是由模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)形成的多蛋白復合物，是先天免疫應答的重要組成部分。模式識別受體包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)、黑色素瘤缺乏因子2受體(absent in melanoma 2，AIM2)等[7]。大多數(shù)NLR包含3個結(jié)構(gòu)域，即C端富亮氨酸重復區(qū)域(leucine-rich repeats，LRR)、中央核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NACHT)、N端熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)。

核苷酸結(jié)合寡核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是最常見的炎性小體。典型的NLRP3炎性小體復合物是一種胞內(nèi)蛋白復合物，由“感應蛋白”NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和“效應器”pro-caspase-1組成[7]。NLRP3炎性小體廣泛分布于免疫細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞等，還可分布于非免疫細胞，如成纖維細胞和心肌細胞等，許多疾病發(fā)生時(高血壓、糖尿病、糖尿病心肌病、動脈粥樣硬化、抑郁癥、阿爾茨海默病、哮喘等)，可發(fā)現(xiàn)NLRP3表達上調(diào)。

NLRP3炎性小體的活化由啟動和組裝兩個獨立且平行的步驟實現(xiàn)。第一步啟動階段，Toll樣受體識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)后，誘導NF-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)轉(zhuǎn)錄，上調(diào)NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18的表達；第二步組裝階段，繼續(xù)由各種PAMPs、DAMPs或病原微生物刺激介導，并促進NLRP3、ASC和pro-caspase-1寡聚進而激活NLRP3炎性小體，隨后產(chǎn)生有活性的caspase-1。caspase-1的激活將無活性的促炎細胞因子pro-IL-1β、pro-IL-18切割為其對應成熟的分泌因子IL-1β和IL-18，并介導細胞焦亡(pyroptosis)[7]。細胞焦亡是一種細胞程序性死亡，其表現(xiàn)與細胞凋亡、細胞壞死的特征部分重疊，如DNA損傷、TUNEL染色陽性、Annexin V染色陽性、細胞膜上孔隙形成、細胞裂解等[8]。因此，NLRP3、caspase-1、IL-1β表達增加以及細胞焦亡是NLRP3炎性小體異常激活并介導炎癥的主要表現(xiàn)。

目前的相關(guān)研究[9]通常把NLRP3炎性小體的激活概括成三條不同的信號通路：① 細胞外ATP誘導K+通過嘌呤能受體(purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor，P2X7)外排，從而導致NLRP3炎性小體的組裝和激活；② PAMPs和DAMPs觸發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，促進NLRP3炎性小體的組裝和激活；③ 細胞內(nèi)形成的結(jié)晶或顆粒結(jié)構(gòu)導致溶酶體破裂以及溶酶體內(nèi)容物如組織蛋白酶B的釋放，從而誘導NLRP3炎性小體的組裝和激活。此外，NLRP3炎性小體的組裝和激活還涉及到其他觸發(fā)因素，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)、自噬功能障礙和Ca2+超載等。

Fig 1 The signaling pathway of NLRP3 inflammasome activation

2 NLRP3炎性小體與糖尿病心肌病

NLRP3炎性小體已被證實與糖尿病心肌病中無菌性炎癥反應有關(guān)，抑制NLRP3炎性小體可有效減輕DCM炎癥反應，從而改善DCM 胰島β細胞功能受損、心肌損傷以及心肌纖維化等過程。

2.1 NLRP3炎性小體參與DCM胰島β細胞功能受損胰島β細胞數(shù)量減少或功能受損導致高血糖是糖尿病的重要發(fā)病機制之一。糖尿病的長期高血糖狀態(tài)可引起持續(xù)性炎癥、氧化應激和心臟收縮功能障礙，是DCM的始發(fā)因素。

研究表明，NLRP3炎性小體可通過分泌IL-1β參與2型糖尿病心肌病的胰島損傷過程。Schroder等[10]發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病發(fā)病過程中，胰島持續(xù)的高血糖狀態(tài)引發(fā)糖酵解增加并過度刺激線粒體電子傳遞鏈導致ROS的生成，ROS作為激動劑激活NLRP3炎性小體并分泌成熟的促炎細胞因子IL-1β。IL-1β升高會引起β細胞死亡和功能障礙，導致葡萄糖刺激的胰島素分泌減少，加速糖尿病的進程。使用IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra)可改善胰島素分泌和降低血糖，提高胰島β細胞存活率，從而改善胰島功能。通過敲除慢性肥胖小鼠的NLRP3基因，可保護胰島β細胞免受細胞死亡，從而減緩肥胖向糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展[11]。孔祥等[12]發(fā)現(xiàn)糖化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)可通過ROS途徑激活巨噬細胞中的NLRP3炎性小體并分泌IL-1β?lián)p傷胰島β細胞，沉默NLRP3基因可改善該過程。

硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interactingprotein，TXNIP)是調(diào)節(jié)胰島β細胞生理病理學功能的關(guān)鍵蛋白。相比其他類型細胞，TXNIP主要在分泌胰島素的β細胞中高度表達。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過PERK和IRE1通路上調(diào)TXNIP的表達，TXNIP作為促發(fā)因子激活NLRP3炎性小體并增加IL-1β分泌，導致β細胞損傷[13]。另外，該過程分泌的IL-1β能夠與胰島β細胞表面的IL-1受體(interleukin-1 receptor，IL-1R)結(jié)合，從而誘導其自身表達，形成更多的IL-1β，加速糖尿病病情的發(fā)展[14]。在糖尿病心肌病模型中，高血糖誘導的ROS生成增多可促使硫氧還蛋白和TXNIP的復合物解離，隨后TXNIP以依賴氧化還原的方式激活NLRP3炎性小體進而產(chǎn)生一系列的生理活動影響胰島的結(jié)構(gòu)和功能[15]。

2.2 NLRP3炎性小體參與DCM心肌損傷過程心肌細胞壞死、凋亡和肥大是造成DCM患者心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷，甚至發(fā)展成為心衰的重要原因。糖尿病高糖、高脂環(huán)境下心肌細胞ROS增多，可促進NLRP3炎性小體激活。李雪蓮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織中活性氧水平升高，心肌凋亡細胞明顯增加以及心肌間質(zhì)呈現(xiàn)明顯的膠原纖維堆積，同時心肌組織中NLRP3和IL-1β基因陽性表達上調(diào)。采用藥物抑制NLRP3炎性小體激活可明顯減輕炎癥和改善心臟功能。Luo等[17]發(fā)現(xiàn)用高糖刺激的H9c2心肌細胞，其caspase-1表達升高，并出現(xiàn)細胞焦亡。沉默NLRP3基因后糖尿病大鼠心肌細胞焦亡和心肌纖維化顯著減少，心臟功能改善。提示NLRP3-caspase-1依賴的細胞焦亡是DCM發(fā)生時心肌細胞死亡的一個重要因素。

心肌細胞凋亡與心肌細胞肥大兩種損傷形式可相互作用，進而影響心臟功能。NLRP3炎性小體不僅通過IL-1β促進結(jié)構(gòu)性心肌病，也可通過IL-1β加重左心室肥厚。Lim[18]研究表明，AGEs可以通過激活NF-κB-NLRP3-IL-1β信號通路誘導心肌肥大。NLRP3敲除可抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激引起的心肌細胞肥大。

2.3 NLRP3炎性小體參與DCM心肌纖維化過程心臟纖維化的特征是由纖維狀膠原組成的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在心肌間質(zhì)中過多沉積。心臟纖維化會導致疤痕組織積累，左心室僵硬度增加，可引發(fā)心臟功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心臟成纖維細胞內(nèi)NLRP3炎性小體活化水平升高。Zhang等[19]表明在DCM的高糖環(huán)境下，ROS和P2X7R可以介導NLRP3炎性小體激活，促進新生大鼠心臟成纖維細胞膠原合成，導致心肌纖維化。相反，H3松弛素(H3 Relaxin)能夠在高糖環(huán)境下明顯減弱P2X7受體介導的NLRP3炎性小體激活，從而抑制心臟成纖維細胞膠原合成[20]。也有研究表明，NLRP3炎性小體的激活會抑制了心肌成纖維細胞中cAMP的釋放并抑制心肌收縮[21]。體外研究表明，IL-1β、IL-18均可通過劑量依賴性的方式刺激膠原蛋白的表達，具有促心肌纖維化作用[22]。

Bracey等[23]發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1的刺激下，心臟成纖維細胞中NLRP3炎性小體的表達增加。另外，NLRP3在心臟成纖維細胞中可以不依賴于細胞因子釋放的新機制促進纖維化信號轉(zhuǎn)導，這主要表現(xiàn)在NLRP3通過NACHT結(jié)構(gòu)域促進R-Smad活化和心肌成纖維細胞分化。活化的R-Smad與Co-Smad 結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復合物從而促進促纖維化基因的表達。在體內(nèi)，NLRP3缺失的心臟成纖維細胞對TGF-β的反應表現(xiàn)為肌成纖維細胞分化受損和R-Smad活化減少。提示NLRP3可直接促纖維化作用。

3 中藥對糖尿病心肌病NLRP3炎性小體的干預作用

目前中藥對糖尿病心肌病NLRP3炎性小體的干預研究起步較早，且多局限于動物實驗方面。云芝是一種傳統(tǒng)藥用真菌，其提取物具有抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等作用。現(xiàn)研究表明，云芝提取物可以通過抑制NF-κB通路減弱NLRP3炎性小體激活，使得DM大鼠caspase-1、IL-1β、IL-18和NLRP3炎性小體水平降低，從而減輕心臟炎癥和改善心功能。此外，云芝提取物還可以通過抑制TGF-β1/ Smad信號傳導，減輕DM大鼠的心臟纖維化[24]。

絞股藍為葫蘆科植物絞股藍Gynostemmapentaphylla(Thunb.)Makino的全草，又名七葉膽、落地生、遍地生根。絞股藍皂苷(Gypenoside，GPS)是絞股藍的主要活性成分之一，具有抗炎、降血糖、保護心臟等作用。在H9C2細胞及DCM的小鼠模型中均發(fā)現(xiàn)高糖誘導NLRP3炎性小體活化可引起心肌細胞凋亡。高糖通過劑量依賴性促進ROS產(chǎn)生從而活化NLRP3炎性小體。絞股藍皂苷通過降低線粒體ROS的水平，即調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的啟動步驟，抑制NLRP3炎性小體的激活以及IL-1β和IL-18的分泌，進而改善糖尿病心肌病的心肌損傷[25]。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于槐花、桑葉、銀杏葉、旋覆花、車前子等中藥。糖尿病大鼠模型經(jīng)槲皮素治療后，可明顯抑制炎性小體蛋白表達量，改善心肌間質(zhì)纖維化病變及心肌凋亡。這表明，槲皮素可通過介導NLRP3炎性小體減輕糖尿病大鼠中高糖誘導的心功能受損[16]。

柚皮素(naringenin)屬于二氫黃酮類化合物，是枳殼、枳實、骨碎補、化橘紅等中藥的主要有效成分之一。柚皮素可通過下調(diào)心臟組織的NLRP3炎性小體蛋白(NLRP3、caspase-1和ASC)、IL-1β及I型膠原蛋白、FN纖粘連蛋白，進而減少心肌細胞凋亡、改善心肌纖維化，抑制心肌重構(gòu)[26]。

中藥成分熊果酸(ursolic acid，UA)廣泛存在于植物界中，如山楂、夏枯草、白花蛇舌草、梔子、車前草等。通過高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立小鼠2型糖尿病模型發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂、心肌組織炎性細胞浸潤、心肌細胞肥大、壞死的情況。熊果酸干預8周后，糖尿病小鼠心肌病變明顯改善，其機制與抑制NLRP3炎性小體活化，減少IL-1β表達有關(guān)[27]。

無患子皂苷(Soapnut Saponin)是野生落葉喬木無患子(SapindusmukorossiGareth.)果皮的提取物，含有豐富的糖苷類物質(zhì)，主要為三萜皂苷類、倍半萜糖苷類。用高糖誘導H9C2細胞損傷和焦亡，caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達水平較正常組升高，免疫組化染色和Western blot結(jié)果均顯示無患子皂苷處理可抑制caspase-1及IL-1β水平。綜上所述，無患子皂苷可通過NLRP3調(diào)控caspase-1、IL-1β等下游基因抑制H9C2心肌細胞損傷[28]。

4 結(jié)語和展望

綜上，NLRP3炎性小體參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程。NLRP3炎性小體活化可誘發(fā)或加劇DCM患者心臟心肌炎癥、心肌細胞壞死或凋亡、心肌纖維化及其他心臟功能障礙。目前以NLRP3為靶點，研究藥物干預糖尿病心肌病作用處于起步階段，已有研究證實中藥的干預作用可影響NLRP3炎性小體的啟動和活化，也可影響其下游基因的表達，進而抑制DCM的心肌損傷，改善心臟功能，但是具體機制尚需深入研究。糖尿病心肌病發(fā)生時，心肌脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)小分子代謝物組譜失衡，而脂質(zhì)代謝產(chǎn)物如神經(jīng)酰胺可以充當NLRP3炎性小體的激活信號，影響糖尿病等代謝性疾病的發(fā)展。研究小檗堿等可通過調(diào)控脂質(zhì)組學改善DCM心肌損傷[29]，并對NLRP3炎性小體有調(diào)控作用[30]，值得深入探討。