煙草煙霧暴露結合基因工程小鼠在COPD藥物靶點及機制研究的應用進展

任周新，趙 迪，沈俊嶺，劉海軍，余海濱，李建生

(1. 河南中醫藥大學中醫藥科學院，河南 鄭州 450046；2. 呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南 鄭州 450046；3. 河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

基因工程技術包括ES細胞打靶技術、CRISPR 基因編輯技術、轉基因技術等，隨著技術的日臻完善，人類改變基因的能力正迅速增強。目前，在改變基因的實驗動物中，小鼠的應用頻率最高，建立了眾多與人類疾病有關的模型[1]。COPD的形成與惡化，決定于內在基因與外在環境因素的共同作用。作為最主要的致病因素煙草煙霧暴露，結合不同的轉基因小鼠，能夠闡釋某種特定基因表達的變化對煙草煙霧暴露動物肺損傷、關鍵信號通路等的影響，闡釋特定基因或信號通路在COPD病理機制中的作用，確定新的藥物作用靶點。本文就煙草煙霧暴露結合基因工程小鼠在COPD病理機制和藥物靶點方面的研究結果，進行了綜合和分析，報導如下。

1 藥物靶點

1.1 Tristetraprolin (TTP)TTP是由鋅指蛋白36 (zinc finger protein-36，ZFP36) 基因編碼的一種RNA結合蛋白，通過與靶細胞因子的3′-非翻譯區的富含腺苷酸和尿苷酸的多種元件的結合，誘導mRNA的破壞，特別是某些編碼炎癥的細胞因子的轉錄本的破壞[2]，可能對COPD具有保護作用。TTP降低mRNA穩定性的作用，被磷酸化和脫磷酸化的兩個特定的殘基所調控，在小鼠是磷脂酰絲氨酸52和178，在人類是磷脂酰絲氨酸60和186[3]。mitogen-activated protein kinase (MAPK)-activated protein kinase 2 (MK2)磷酸化TTP，并使之失活，導致靶mRNA的穩定[4]。蛋白磷酸酶2A(PP2A)，使TTP脫磷酸化，提高其活性，促進靶mRNA的穩定性丟失[5]。而活化的TTP又被泛素-蛋白酶體系統作為靶點，被其降解[5]。這些方式中，關鍵的磷脂酰絲氨酸的磷酸化控制了TTP的功能，這些磷脂酰絲氨酸如同一個分子開關：磷酸化，功能關閉，脫磷酸化，開放。所以，如果將TTP作為一個新的抗COPD的抗炎靶點，它具有易于控制的優點。Nair等[5]使用了一種基因修飾的組成型的TTP活化小鼠品系，其內源性TTP蛋白的磷脂酰絲氨酸52和178被不能被磷酸化的丙氨酸殘基所取代(Zfp36aa/aa)[6]。這兩個氨基酸殘基的置換，導致TTP結構性的活化，起到一種mRNA脫穩定性的作用。應用Zfp36aa/aa小鼠，檢測活化的TTP對實驗性煙草煙霧(cigarette smoke，CS)誘導COPD的影響。發現活化的TTP對實驗性COPD的多種特征具有保護效應，如肺炎癥減輕、氣道重構減輕、肺泡擴張減輕和肺功能改善。隨后在野生型的C57BL/6J小鼠中，用一種PP2A激動劑(AAL(s))，以活化TTP，單獨或合用蛋白酶體抑制劑bortezomib，隨后評估這些干預對CS誘導的實驗性COPD的影響。結果表明藥物活化TTP能夠減輕疾病的典型表現。該研究結果展示出應用藥物活化TTP，具有減輕COPD的潛能。

1.2 晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)晚期糖基化終末產物受體是一種多配體的受體。煙草煙霧中含有RAGE的配體，已經被證實是COPD的病原之一。野生型和RAGE基因敲除小鼠，分別暴露于CS。比較后發現，RAGE基因敲除小鼠的肺組織炎癥病變明顯減輕，肺泡灌洗液中炎癥相關因子和中性粒細胞數量減少。該結果表明敲除RAGE，能緩解CS誘導的氣道炎癥。cDNA微列陣比較后發現，作用途徑可能為S100A8/A9的表達下調以及與之相關的免疫-炎癥反應下調[7]。另有研究結果發現[8]：敲除RAGE基因或者應用RAGE抑制劑FPS-ZM1，阻止CS誘導小鼠的肺氣腫的進展。對暴露于CS的敲除RAGE小鼠或C57BL/6野生型小鼠的肺泡巨噬細胞執行了無偏基因表達譜分析，通過比較，識別出一些COPD發病機制必需的基因，表明在CS誘導的巨噬細胞活化中，RAGE是必需的組成部分[8]。兩種來源的細胞，最顯著的差異是Nrf2介導的基因表達。敲除RAGE小鼠巨噬細胞Nrf2介導的基因表達和肺組織4-羥基壬稀醛 (4-hydroxynonenal，4-HNE)減少，說明在CS刺激時，敲除小鼠的肺氧化應激水平較低。但是，兩種小鼠CS暴露相同、肺泡灌洗液中的巨噬細胞數量相似、肺組織CD45陽性表達細胞和中性粒細胞陽性表達細胞的百分率也相似[8]，提示CS介導的氧化應激可能需要RAGE的介導。另外，對于CS暴露，敲除小鼠巨噬細胞表現出內質網應激的減弱[8]。這些研究表明：在CS誘導的肺巨噬細胞的活化過程和肺損傷過程中，RAGE具有重要的作用；抑制RAGE是COPD治療的新的可能的途徑。

1.3 衰老細胞細胞的衰老由Cdkn2a基因座所介導，其編碼兩個重要的腫瘤抑制因子，命名為p16Ink4a和 p19Arf [9]。Hashimoto等[10]通過消融Arf表達的細胞，構建了一種ARF-DTR轉基因小鼠，提高了小鼠的肺功能。預先用白喉毒素清除Arf表達的細胞，可減輕彈性蛋白酶誘導的肺損傷，對肺組織產生一定的保護效應[11]。進一步的研究發現：長期的煙草煙霧暴露導致肺功能異常，肺形態結構異常，衰老標志性蛋白Ink4a和Arf在肺組織的表達增加；在煙草煙霧暴露前，清除Arf表達的細胞，減輕了上述煙霧誘導的表型變化。另外發現：在肺損傷后，清除Arf表達的細胞，在煙草煙霧提取物攻擊的小鼠中，也產生了有益的影響；初步的研究結果發現，清除衰老細胞的保護效應，與巨噬細胞等分泌的彈性裂解酶的產量或活性降低有關[12]。這些結果提示：衰老細胞是COPD重要的治療靶點。

2 炎癥和免疫反應

2.1 正常肺和炎癥肺正常的肺和炎癥的肺對于CS刺激反應的比較，對于理解COPD的形成與發展是有益的。βENaC小鼠，是一種轉基因過表達Scnn1b的小鼠，該基因能夠編碼存在于氣道的上皮細胞的Na+通道β亞單位(βENaC)。βENaC小鼠具有脫水的氣道黏液，自發形成慢性支氣管炎和肺氣腫，包括黏液細胞化生、黏液高分泌、輕度的中性粒細胞性炎癥、大的泡沫狀巨噬細胞以及氣道黏液和氣道壁的淋巴細胞數量的增加[13]。Engle等[14]應用野生小鼠和βENaC慢性肺炎小鼠，暴露于CS或對照空氣，分別暴露1 d和5 d。在肺組織或肺泡灌洗液中，對照βENaC小鼠的白細胞數量、中性粒細胞數量、巨噬細胞數量和淋巴細胞數量均高于對照或CS野生小鼠，反映了βENaC小鼠自發性存在肺組織炎癥。CS刺激后，野生小鼠肺出現輕度的炎癥反應。與βENaC對照組比較，CS暴露的βENaC小鼠白細胞數量、巨噬細胞數量和淋巴細胞數量均未見明顯變化；但中性粒細胞數量，盡管在暴露1 d，沒有差異；但在暴露5 d后，CS暴露的βENaC組反而顯著減少。兩種模型顯示出：暴露1 d的炎癥介質的變化較暴露5 d的介質變化，改變的數量更多。轉錄組學的結果顯示：暴露1 d或5 d，野生或βENaC小鼠的許多基因和基因集的反應相似，如氧化應激的相關基因上調而免疫反應的基因下調。僅有少許基因的調節和生物反應存在不同：與對照的空氣暴露組比較，煙霧暴露組的細胞外基質相關基因和基因集，在暴露1 d上調，但在5 d下調。綜合分析，這些結果表明，一次煙霧暴露后，肺基因表達發生了快速的變化，重復性的短期暴露沒有明顯改變基因表達的變化；在已經出現炎癥的肺組織，通過下調某些炎癥反應，對重復的后續煙霧刺激損傷，具有一定的保護作用。該結果支持下述假說：對于煙霧刺激，早期的肺組織快速產生一些反應，對于重復性肺損傷，產生保護作用[14]。該假說從某種程度上闡釋了吸煙者需要多年的吸煙史，長期而持續的煙霧刺激，才可能導致氣道和肺泡的病變，最終形成COPD。

2.2 繼發性免疫反應細胞在COPD中，肺組織出現繼發性免疫反應細胞數量的增加，主要是浸潤的CD4+T，CD8+T和B淋巴細胞。CD8+T不足的小鼠(CD8-/-)，而不是CD4+T不足的小鼠，對CS誘導的肺損傷，具有一定的抵抗性，特別是阻止巨噬細胞的積聚、MMP2和MMP9活化以及肺氣腫[15]，表明在疾病的病理機制中，CD8+T細胞起到了某種關鍵的作用。與野生型對照組比較，缺乏成熟的T細胞和B細胞(Rag2-/-)的小鼠，在炎癥和肺氣腫方面，沒有變化[16]。然而，從CS暴露的野生小鼠中過繼輸送CD3+T細胞到Rag2-/-小鼠，后者就形成了類似COPD的表現，說明在COPD的形成和發展中，病原性的T細胞具有某種關鍵的作用。長期暴露于CS的野生型小鼠與Rag1-/-小鼠，肺炎和肺功能沒有差異，但Rag1-/-小鼠氣道膠原沉積更為嚴重，IL-33，IL-13以及ILC2的數量也增加；說明在實驗性的COPD中，T/B淋巴細胞在氣道膠原沉積和纖維化中，發揮作用，但在炎癥中沒有作用[17]。

2.3 2型固有淋巴細胞2型固有淋巴細胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2s)，在溝通天然免疫反應和繼發性免疫反應以及維持肺內環境穩態方面，發揮重要的作用[18]。ILCs細胞屬于組織定居的淋巴細胞，根據不同的刺激，這些細胞顯示出可塑性[19]。在COPD中，用IL-1β、IL-4和IL-12等刺激，ILC2s發生表型轉化，形成了ILC1s細胞或ILC3S細胞；ILC1S：ILC2S比率的增加，與肺功能降低以及疾病的嚴重性之間，存在直接的相關性[19]。ILC2不足的轉基因Rorafl/flII7rCre小鼠與野生型小鼠，長期給予CS暴露，盡管Rorafl/flII7rCre小鼠的肺氣腫程度減輕，但膠原沉積以及IL-33和IL-13的表達沒有改善[17]。這些研究提示：ILC2s細胞在實驗性COPD中，在CS誘導的氣道重構和肺氣腫中，產生一定的保護作用，但對炎癥沒有影響。

2.4 DNER/Notch通路在COPD的臨床研究中，全基因組關聯(genome-wide association studies，GWAS)方法得到了廣泛的應用，成為獲取目標性狀關聯的候選基因或基因區域的有力工具[20]。應用該技術，Busch等[21]發現吸煙者氣道上皮的DNER(Delta Notch like epidermal growth factor related receptor,DNER)內在區的一個單核苷酸多態性(SNP)與FEV1/FVC 比率或 FEV1之間，存在最顯著的相關性；與COPD的遺傳風險之間也存在關聯。

DNER是一種跨膜蛋白，屬于非經典的Notch配體家族，它的膜外段與Notch1受體結合，以一種獨立于CSL(CBF1 Suppressor of Hairless，Lag-1)的方式，活化Notch通路。在人的肺組織中，DNER是促炎巨噬細胞的主要表型[22]。通過應用DNER基因工程小鼠，結合煙草煙霧暴露，進一步闡釋了DNER/Notch通路的作用機制：

首先，從煙草煙霧暴露的野生型小鼠中，發現肺組織巨噬細胞DNER表達升高，接著發現，促炎的M1骨髓源性巨噬細胞(M1 bone marrow derived macrophages，M1BMDM)DNER的表達升高[23]。隨后的研究選擇了一種敲除了DNER的小鼠，沒有發現敲除DNER對巨噬細胞的極化有影響，推測DNER在M1BMDM的高表達，可能通過調節信號通路發揮作用[23]。采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)比較野生小鼠和敲除DNER小鼠的M1BMDM，發現干擾素(interferon，IFN)信號通路在野生小鼠最為富集，兩者差異明顯，這可能反映了敲除DNER小鼠的M1BMDM存在IFN信號通路的破壞或不足。接著發現敲除DNER小鼠的M1 BMDM細胞受到刺激后，II型干擾素(type II interferon，IFNγ)誘導表達顯著降低；GESA顯示M1的IFNγ信號富集，敲除小鼠低而野生小鼠高。盡管T細胞是IFNγ的主要來源，然而已經分化的野生小鼠T細胞亞群表達很低的DNER，提示T細胞的DNER不可能調節產生大量的IFNγ；因此，高表達DNER的M1巨噬細胞才是導致IFNγ高表達的原因[23]。在隨后的體內實驗中，野生型小鼠和敲除DNER小鼠分別暴露于CS，結果發現：在M1巨噬細胞內，DNER表達被啟動；IFNγ增加，需要DNER的表達；在慢性炎癥中，DNER調節巨噬細胞分泌IFNγ；產生IFNγ的巨噬細胞屬于募集的巨噬細胞而不是定居的巨噬細胞；在肺募集的巨噬細胞內，DNER調節IFNγ的分泌。最后發現敲除DNER小鼠的巨噬細胞內，NICD1的核轉位顯著減少；兩種小鼠巨噬細胞的GSEA比較，野生小鼠的Notch1信號通路更為富集。據此認為：借助于DNER，CS誘導體內肺巨噬細胞的Notch1信號通路的活化，隨后誘導IFNγ高表達。

3 總結與展望

目前，COPD的個體化治療已經成為共識，個體基因的異常是導致COPD出現不同臨床表型的重要因素[24]。個體化治療的本質應該反映COPD基因型在致病條件下的復雜而豐富的差異性變化。

隨著分子生物學、生物信息學等技術的發展，人們已經識別出了越來越多的COPD表型及其特異性的基因，建立了一種較為成熟的研究模式(Fig 1)。首先，通過GWAS等技術檢測正常人和COPD患者，發現表達差異性強的基因和基因座，作為潛在的COPD易感基因和基因座。然后，選擇改變某個待篩查基因的小鼠和作為對照的野生小鼠，分別給予煙草煙霧刺激，比較兩者間COPD重要指標的變化；另外，應用激動劑或拮抗劑干預該基因在COPD野生小鼠的表達，再次驗證該基因是否與COPD的發生和發展有關。這種模式，在探索COPD發病機制和藥物干預靶點的研究中，已經得到了應用，取得了一定的進展。

Fig 1 Pattern of combination of cigarette smoke exposure and genetically engineered mice for interest genes searches in COPD

未來，煙草煙霧暴露結合基因工程小鼠的研究模式，將推進COPD復雜表型的準確識別，促進由不同的靶基因改變小鼠結合煙草煙霧暴露的COPD模型體系的建立與完善，推動COPD個體化治療的建立與發展。