抗菌肽GH12對(duì)齲相關(guān)三菌種生物膜形貌及菌種構(gòu)成的影響

李欣蔚 王雨霏 姜文韜 張凌琳

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，成都610041

齲病是在牙菌斑、宿主、食物、時(shí)間等四聯(lián)因素影響下，牙體硬組織發(fā)生的慢性進(jìn)行性破壞的疾病。牙菌斑是三維結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群落，包括微生物、多糖、蛋白質(zhì)和DNA[1]，構(gòu)成牙菌斑的微生物包括致齲菌和共生菌，其群落內(nèi)部有著復(fù)雜的共生和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。其中變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是公認(rèn)的主要致齲菌之一，其毒力因子包括產(chǎn)酸性、耐酸性以及維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的能力[2]。血鏈球菌（Streptococcus sanguinis，S. sanguinis）和格氏鏈球菌（Streptococcus gordonii，S.gordonii）因產(chǎn)堿和產(chǎn)生H2O2等原因拮抗S. mutans[3]，一般與齲發(fā)生率降低密切相關(guān)[4-5]。因此，抑制牙菌斑內(nèi)S. mutans的生長(zhǎng)，減少S. mutans生物量和占比，破壞生物膜的結(jié)構(gòu)與形貌的完整性是降低其致齲性的有效途徑。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）擁有快速殺菌作用和多種殺菌機(jī)制，能夠有效地抑制浮游菌生長(zhǎng)和生物膜形成，并且已經(jīng)有研究[6]證實(shí)其與口腔健康密切相關(guān)。目前，已經(jīng)有大量關(guān)于天然或合成AMPs對(duì)致齲菌效果的研究[7-9]。本課題組在前期自主設(shè)計(jì)并且成功合成了一種抗菌肽GH12，已經(jīng)證實(shí)GH12 無(wú)明顯細(xì)胞毒性，在唾液中能夠保持良好的穩(wěn)定性，且具有優(yōu)越的抗菌性能[10-11]，抑制S.mutans的多種毒力因子，減少胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS） 合成，抑制生物膜形成[12]，還能清除已形成的S. mutans生物膜[10]。

然而，這些研究?jī)H僅關(guān)注了GH12對(duì)S.mutans的浮游菌和單菌種生物膜的作用，尚需要進(jìn)一步研究GH12能否對(duì)多菌種生物膜內(nèi)部的S.mutans發(fā)揮殺傷作用，并由此改變生物膜的形貌及菌種構(gòu)成，使得生物膜向更易清除的方向轉(zhuǎn)化。綜上，本研究擬通過(guò)結(jié)晶紫染色、掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）和熒光原位雜交（flu‐orescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）的方法探究GH12 能否改變齲相關(guān)三菌種生物膜的形貌及菌種構(gòu)成，并通過(guò)選擇性計(jì)數(shù)法探究GH12 能否降低S.mutans的比例。

1 材料和方法

1.1 多肽合成和試劑

多肽GH12的序列為谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-色氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸-組氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸-組氨酸。GH12 由吉爾生化有限公司（中國(guó)）進(jìn)行合成、鑒別并純化至98%，溶解于無(wú)菌去離子水中，冷凍于-20 ℃。除特別說(shuō)明外，所有試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 細(xì)菌與生物膜培養(yǎng)

S.mutansATCC 700610，S.gordoniiATCC 35105以及S.sanguinisJCM 5708 由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。在培養(yǎng)生物膜前，挑取具有典型形態(tài)的單菌落接種于腦心浸液（brainheart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧環(huán)境（85%N2，10%H2和5%CO2）下增菌24 h。

齲相關(guān)三菌種生物膜模型的建立方法如前所述[13]。3 種細(xì)菌懸濁液1∶1∶1 加入BHIS（含1%蔗糖的BHI）培養(yǎng)基中，構(gòu)成混合菌液備用。將1 mL 混合菌液與不同濃度梯度的GH12 溶液加入24 孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)菌終濃度均為1×106CFU·mL-1，GH12 終濃度分別為2、4、8 mg·L-1，對(duì)照組不含GH12。將24 孔板置于37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h及48 h。每24 h更換一次培養(yǎng)基。

1.3 生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)

將1 mL 混合菌液與不同濃度梯度的GH12 溶液加入24 孔板內(nèi)，24 h 及48 h 后，吸去上清，PBS 緩沖液漂洗去除浮游菌，甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，去除多余染料后，使用無(wú)水乙醇重溶結(jié)晶紫，測(cè)595 nm 處的光密度（opti‐cal density，OD）值[10]。

1.4 SEM觀察

PBS緩沖液洗滌生物膜，2.5%戊二醛固定2 h，乙醇梯度脫水（35%、50%、75%、90%、100%，各30 min）[14]。臨界點(diǎn)干燥，噴金鍍膜，在SEM 下觀察生物膜。

1.5 FISH

FISH 熒光探針見(jiàn)表1[13,15]。將培養(yǎng)24 h 和48 h生物膜的玻片置于4%多聚甲醛中過(guò)夜，無(wú)菌水漂洗后在46 ℃下干燥。加入0.5 mL 含有30 mg·mL-1溶菌酶的裂解緩沖液（50 mmol·L-1乙二胺四乙酸，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0）。37 ℃孵育20 min后，漂洗樣本，依次用50%、80%和100%濃度的乙醇連續(xù)脫水3 min。在46 ℃下干燥10 min 后，樣本在50 μL、pH 8.0的含有2 nmol·L-1特異探針的雜交緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，0.9 mol·L-1Na‐Cl，20%甲酰胺，0.01%十二烷基硫酸鈉） 中46 ℃下避光孵育90 min。48 ℃下用pH 8.0 的預(yù)熱洗滌緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1乙二胺四乙酸，215 mmol·L-1NaCl，0.01%十二烷基硫酸鈉）將樣本潤(rùn)洗15 min，再用無(wú)核酸酶水漂洗。激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scan‐ning microscope，CLSM）采用×100油鏡對(duì)生物膜進(jìn)行觀察。

表1 FISH特異性熒光探針Tab 1 Specific fluorescent probes used in FISH

1.6 S.mutans的選擇性計(jì)數(shù)

PBS 潤(rùn)洗后，用1 mL PBS 緩沖液收集入生物膜EP 管中，超聲振蕩分散均勻，10 倍梯度稀釋后，分別接種至BHI 瓊脂平板及輕型唾液鏈球菌-桿菌肽瓊脂（mitis salivarius with bacitracin agar，MSB）平板內(nèi)。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)及菌落形成單位（colony-forming units，CFU）計(jì)算。根據(jù)CFU 計(jì)數(shù)計(jì)算出MSB 平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)與BHI 平板上菌落數(shù)的比值，即為S. mutans在齲相關(guān)三菌種生物膜中的比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD 試驗(yàn)比較組間差異。顯著性水平α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)晶紫染色結(jié)果

結(jié)晶紫染色結(jié)果見(jiàn)圖1。GH12 處理后24 h，生物膜OD 值明顯降低，說(shuō)明生物膜形成量下降。48 h 生物膜在GH12 處理后，OD 值同樣呈下降趨勢(shì)，但需要更高濃度GH12（4、8 mg·L-1）處理，形成量才有明顯變化。

圖1 GH12處理后齲相關(guān)三菌種生物膜的結(jié)晶紫染色結(jié)果Fig 1 Crystal violet staining of cariogenic three-species biofilm treated by GH12

2.2 SEM觀察結(jié)果

SEM 觀察顯示，對(duì)照組24 h 生物膜層次多，密度高，結(jié)構(gòu)緊湊；經(jīng)不同濃度GH12處理后的生物膜立體形貌崩解，密度逐漸變低，結(jié)構(gòu)越發(fā)松散；8 mg·L-1GH12 處理后不能形成生物膜。48 h生物膜結(jié)構(gòu)和形貌變化趨勢(shì)與24 h 生物膜基本相同，但變化更加明顯（圖2）。

2.3 FISH

為進(jìn)一步觀察GH12對(duì)齲相關(guān)三菌種生物膜形貌及菌種構(gòu)成的影響，采用FISH 對(duì)其進(jìn)行了研究。如圖3、4 所示，與24 h 生物膜相比，48 h 生物膜的生物量更多，密度更高，結(jié)構(gòu)更緊湊。與對(duì)照組相比，經(jīng)4 mg·L-1和8 mg·L-1GH12 處理的生物膜失去了典型的三維立體結(jié)構(gòu)，并且密度更小，更加疏松。在菌種構(gòu)成的定性分析方面，隨著GH12 濃度的增加，在24 h 生物膜中，S.mutans的數(shù)量逐漸減少，而S.sanguinis和S.gordonii卻保持著相當(dāng)?shù)纳锪俊．?dāng)GH12 濃度為8 mg·L-1時(shí)，生物膜中的S. mutans幾乎被完全消除，S. sanguinis含量也有所降低，S.gordonii成為主要菌種構(gòu)成（圖3）。在48 h生物膜中，S.mutans數(shù)量同樣呈下降趨勢(shì)，其余兩種細(xì)菌比例也逐漸上升。由此可知，齲相關(guān)三菌種生物膜的菌種構(gòu)成發(fā)生了變化，GH12 對(duì)S. mutans有明顯選擇抑制作用，繼而S.sanguinis和S.gordonii逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位（圖4）。

2.4 CFU計(jì)數(shù)

S.mutans的選擇性計(jì)數(shù)可以定量比較S.mutans所占比例的變化。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組生物膜中S. mutans的占比也略有下降，不同濃度的GH12可不同程度地降低S.mutans的占比（表2）。經(jīng)GH12處理，24 h生物膜中的S.mutans生物量和占比都隨著GH12的濃度增加顯著減少；經(jīng)8 mg·L-1GH12 處理后，S.mutans無(wú)法檢出。48 h 生物膜表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，只是變化程度更劇烈。

圖2 GH12處理后齲相關(guān)三菌種生物膜SEM圖像Fig 2 SEM images of cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment

3 討論

隨著對(duì)致齲菌和共生菌之間動(dòng)態(tài)平衡了解的逐漸深入，調(diào)節(jié)牙菌斑的形成，抑制致齲菌的生長(zhǎng)是生態(tài)防齲策略的要求之一[16]。S. mutans產(chǎn)生的EPS 為細(xì)菌提供了吸附位點(diǎn)，并作為支撐細(xì)菌空間分布的基質(zhì)[17]，有助于細(xì)菌的黏附以及生物膜的形成與結(jié)構(gòu)完整性。完整的生物膜為產(chǎn)酸耐酸細(xì)菌提供了安全的避難所，確保持續(xù)的局部酸性生產(chǎn)，使pH 降低進(jìn)而導(dǎo)致牙面脫礦[18]。因此破壞生物膜的完整性可降低生物膜的致齲能力。

本研究中，結(jié)晶紫染色提示GH12處理后齲相關(guān)三菌種生物膜形成量下降，完整性明顯降低。48 h生物膜雖然形成量高于24 h，但同樣呈下降趨勢(shì)。然而隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，2 mg·L-1GH12 處理后的48 h 生物膜與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2 mg·L-1GH12 僅能抑制部分S.mutans毒力因子和相關(guān)基因與該現(xiàn)象有關(guān)[12]。

生物膜形貌和結(jié)構(gòu)的變化來(lái)源于其菌種構(gòu)成的變化。FISH 和S.mutans選擇性計(jì)數(shù)的結(jié)果均顯示GH12處理后的齲相關(guān)三菌種生物膜中S.mutans占比明顯降低。GH12 對(duì)S. mutans有顯著抑制作用，但對(duì)S. sanguinis和S. gordonii的抑菌作用較弱，后者細(xì)菌數(shù)量和比例保持了相當(dāng)高的水平。因此，GH12 可通過(guò)選擇性抑制生物膜中S.mutans的生長(zhǎng)，進(jìn)而改變其菌種構(gòu)成，降低其致齲性。值得注意的是，8 mg·L-1GH12 處理后，生物膜中的S.gordonii占絕對(duì)的種群優(yōu)勢(shì)。前期研究發(fā)現(xiàn)S.sanguinis對(duì)GH12 的敏感性高于S. gordonii[10]，而且S. gordonii在定植位點(diǎn)的種間競(jìng)爭(zhēng)中占有優(yōu)勢(shì)，甚至可輕微抑制S.sanguinis[19]。因此，在S.mutans被GH12 全面抑制或清除的微生態(tài)中，S. gordonii的競(jìng)爭(zhēng)力比S.sanguinis更強(qiáng)，故占據(jù)了種群優(yōu)勢(shì)。

圖3 GH12處理24 h后齲相關(guān)三菌種生物膜FISH圖像 CLSM ×100Fig 3 FISH images of 24 h cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment CLSM ×100

本研究采用培養(yǎng)法計(jì)算生物膜中S. mutans的占比，其基礎(chǔ)是改良MSB 培養(yǎng)基的選擇性培養(yǎng)特性。改良MSB 培養(yǎng)基是一種分離S.mutans最佳的選擇性培養(yǎng)基，能抑制遠(yuǎn)緣鏈球菌的生長(zhǎng)，S.mutans在該培養(yǎng)基上形成有鑒別意義的深藍(lán)色“霜玻璃”樣菌落[20]。培養(yǎng)法僅計(jì)數(shù)活菌數(shù)量，因此可以比較真實(shí)地反映生物膜中存活的S. mutans。然而FISH 觀察發(fā)現(xiàn)48 h 三菌種生物膜綠色染色更致密。FISH 利用熒光寡核酸探針，靶向結(jié)合細(xì)菌的16s rRNA[21]，死活菌均可被探針標(biāo)記，因此反映的是生物膜中各菌的總生物量。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，胞外基質(zhì)會(huì)累積，死活菌的代謝更久，因此48 h生物膜染色實(shí)驗(yàn)的總量均會(huì)高于24 h。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）也可估算生物膜中S. mutans的含量，這種方法需要首先提取細(xì)菌的DNA作為模板，使用qPCR 獲得各種模板擴(kuò)增至特定熒光值所需的循環(huán)數(shù)（Ct 值），再通過(guò)Ct 值與CFU的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得各菌種的數(shù)目[22]。與FISH 類(lèi)似，qPCR 由于無(wú)差別提取生物膜中存在的所有DNA，包括死亡細(xì)菌的DNA，所以在描述生物膜中存活的S.mutans的比例上可能存在一定偏差。

圖4 GH12處理48 h后齲相關(guān)三菌種生物膜FISH圖像 CLSM ×100Fig 4 FISH images of 48 h cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment CLSM ×100

綜上所述，本研究證實(shí)了抗菌肽GH12能改變齲相關(guān)三菌種生物膜的結(jié)構(gòu)和形貌，并有效降低生物膜中S. mutans的占比，調(diào)控生物膜的種群關(guān)系。但還需要對(duì)GH12對(duì)天然牙菌斑的調(diào)控和防齲效果等進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為GH12投入臨床防齲提供更豐富的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。