仿生修復(fù)技術(shù)在口腔頜面部硬組織缺損修復(fù)中的應(yīng)用進展

牛麗娜 焦凱 方明 陳吉華

軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院，西安710032

口腔頜面部硬組織主要包括牙齒及頜面骨組織，二者密切相連，功能互相支持，共同構(gòu)成了人類咀嚼、語言和容貌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，支撐了頜面部外形結(jié)構(gòu)。然而創(chuàng)傷、腫瘤、老齡化等原因，常常導(dǎo)致口腔頜面部硬組織缺損，既影響患者的咀嚼、發(fā)音功能，又影響患者的社交與心理健康。因此，口腔頜面部硬組織缺損的修復(fù)是關(guān)乎國民健康與生活質(zhì)量的重大科學(xué)問題。由于口腔頜面部硬組織的自我修復(fù)能力有限，目前主要依靠人工合成的材料對缺損區(qū)進行替代性修復(fù)。雖然臨床上使用的人工合成材料來源廣泛，但其理化性能及結(jié)構(gòu)特性與人體硬組織差距巨大，存在免疫排異、材料降解慢、修復(fù)性能差等問題，導(dǎo)致修復(fù)效果不佳。其根本原因在于這些材料的仿生度較差，從而導(dǎo)致與機體組織整合能力不足[1]。因此，如何對材料結(jié)構(gòu)、功能進行仿生化構(gòu)建以模擬缺損組織的特征，是制備理想組織缺損修復(fù)材料的核心問題。

牙和骨是以礦化膠原為基本結(jié)構(gòu)單元，通過生物礦化形成的，具有多層次有序結(jié)構(gòu)的硬組織。其修復(fù)的關(guān)鍵在于與組織結(jié)構(gòu)高度仿生的材料構(gòu)建[2]，因而仿生礦化技術(shù)對口腔頜面部硬組織修復(fù)具有重要指導(dǎo)意義。近年來隨著仿生礦化機制探索逐步深入，硬組織修復(fù)技術(shù)在不斷進步與革新，故本文將對近年來仿生礦化在牙頜面硬組織缺損修復(fù)中的研究進展進行介紹。

1 生物礦化及仿生礦化

生物礦化現(xiàn)象在自然界中普遍存在，可將其概括為無機礦物質(zhì)在生物多重因素共同精確調(diào)控下成核、組裝及生長的過程。生物礦化主要分為生物誘導(dǎo)礦化和生物控制礦化。前者指生物不直接參加礦化過程，而是通過生物代謝誘導(dǎo)礦物的形成，主要見于藻類等低等生物。生物控制礦化則指生物對礦物的形成起到直接程序化調(diào)控作用，所形成的礦物往往呈現(xiàn)高度有序性。本文中所提到的牙、骨組織的形成過程主要涉及生物控制礦化[3]。生物體內(nèi)的礦物與有機大分子選擇性結(jié)合，形成了精妙的多級有序結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)特性賦予生物礦物優(yōu)異的機械性能，并為人工材料的合成提供了設(shè)計思路和模仿典范。仿生礦化則是受生物礦化機制的啟發(fā)，通過人工方法在體外合成具有類似生理結(jié)構(gòu)層次及相應(yīng)功能的復(fù)合材料，以期為硬組織缺損提供優(yōu)良修復(fù)策略。同時仿生礦化的體外模型也被反過來用于揭示生物礦化的本質(zhì)，進一步推動了生物礦化的研究進展。二者相輔相成，共同推進了硬組織仿生修復(fù)的發(fā)展進程。

2 口腔頜面部硬組織仿生修復(fù)

2.1 牙體硬組織仿生修復(fù)

齲齒是牙體硬組織最好發(fā)的病損之一，其主要病理過程為致齲菌與食物殘渣相作用產(chǎn)生酸性物質(zhì)，引起牙齒脫礦。當(dāng)牙齒脫礦速度大于再礦化速度時，牙體硬組織的有序結(jié)構(gòu)便會受到破壞，從而形成齲壞。目前臨床上修復(fù)齲齒主要通過復(fù)合樹脂材料對齲洞進行充填。然而樹脂修復(fù)材料與牙齒組織間密合性差，易形成邊緣微滲漏引起繼發(fā)齲，遠期修復(fù)效果不佳。因此通過仿生礦化技術(shù)，于受損牙體表面形成一層與原有牙體組織結(jié)構(gòu)相近的修復(fù)層，對于治療及預(yù)防齲齒發(fā)展具有重要臨床意義。

2.1.1 釉質(zhì)仿生修復(fù) 位于牙齒最外層的釉質(zhì)是應(yīng)對齲壞的第一道防線，齲齒往往始發(fā)于釉質(zhì)層（根面齲除外），繼而向深部的牙本質(zhì)發(fā)展。因此，釉質(zhì)的仿生修復(fù)在預(yù)防早期齲進展中至關(guān)重要。釉質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征為成捆針狀羥磷灰石晶體（hy‐droxyapatite，HAP），其礦化形成過程中可概括為，以釉原蛋白為首的釉質(zhì)基質(zhì)蛋白穩(wěn)定鈣磷離子，形成無定形磷酸鈣（amorphous calcium phos‐phate，ACP），即礦化前體，之后由ACP組裝形成高度有序排列的HAP[4]。因此，對釉質(zhì)仿生修復(fù)的一個關(guān)鍵策略是通過釉質(zhì)基質(zhì)蛋白或其模擬物誘導(dǎo)脫礦釉質(zhì)再礦化。有學(xué)者[5]在體外利用釉原蛋白誘導(dǎo)磷酸鈣礦化，形成的HAP 與釉質(zhì)結(jié)構(gòu)類似。此外，有一些多肽擁有與釉原蛋白相似的功能。P11-4 是一種體外設(shè)計出的小分子肽段，可擴散至齲損深層，并自組裝形成具有類似釉質(zhì)基質(zhì)表面特征的三維支架。P11-4 自組裝后表面呈負電荷，具有潛在的鈣離子結(jié)合位點，可用于控制HAP 的沉積與晶體生長[6]，多項研究[7-9]證實，P11-4具備優(yōu)異的再礦化效果。然而上述分子在純化、儲存等方面存在困難，限制了其臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用。一些高分子聚合物亦具備誘導(dǎo)礦化的能力，這吸引了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。例如聚酰胺[poly（amidoamine），PAMAM]，它是一種體外合成的樹枝狀大分子，模擬了釉原蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，可作為調(diào)控HAP 合成的模板[10]。PAMAM 可經(jīng)多種官能團修飾，例如天冬氨酸、硬脂酸、磷酸二甲酯等。經(jīng)過修飾，PAMAM具備與釉原蛋白相近的組裝功能，誘導(dǎo)HAP 取向生長[11]。PAMAM 誘導(dǎo)的再礦化深度可達100 μm，解決了齲損部位深層難以再礦化修復(fù)的難題[12]。

除了模仿釉質(zhì)礦化中釉原蛋白的作用外，另有學(xué)者[13-14]直接通過礦化前體ACP對脫礦釉質(zhì)進行再礦化。常規(guī)ACP 的狀態(tài)不穩(wěn)定，易形成沉淀，難以儲存，于是學(xué)者們利用穩(wěn)定劑維持ACP 的穩(wěn)態(tài)從而解決了這一困難。例如酪蛋白磷酸多肽（casein phosphopeptide，CPP），這種多肽具有大量的酸性基團，可以與鈣離子等礦物質(zhì)結(jié)合，穩(wěn)定ACP 并形成CPP-ACP 復(fù)合體。穩(wěn)定后的ACP 可沉積于牙體結(jié)構(gòu)上，實現(xiàn)脫礦釉質(zhì)層的再礦化[15-16]。CPP-ACP處理后的病變釉質(zhì)表面粗糙度顯著降低，顯微硬度明顯提高，有助于修復(fù)釉質(zhì)齲并延緩病變的發(fā)展[15]。

然而上述研究中所產(chǎn)生的再礦化層與原釉質(zhì)間存在分離界面，未能達到真正意義上的“釉質(zhì)修復(fù)”。為解決此難題，學(xué)者們從生物礦化的機制中尋求答案。在硬組織發(fā)育過程中ACP 常與晶體緊密結(jié)合形成礦化前沿界面，若能模擬這一過程，將對釉質(zhì)仿生修復(fù)有重要指導(dǎo)意義。磷酸鈣離子團簇可形成礦化前體層，很好地模擬了自然界硬組織發(fā)育中的結(jié)晶-非晶態(tài)邊界，并能夠誘導(dǎo)釉質(zhì)HAP 晶體的外延生長，在脫礦釉質(zhì)表面成功地形成了2～10 μm的新生釉質(zhì)層，且與原釉質(zhì)層間未見明顯分離界面及縫隙，實現(xiàn)了釉質(zhì)晶格的連續(xù)外生修復(fù)[17]。此種修復(fù)方法不僅恢復(fù)了脫礦釉質(zhì)的結(jié)構(gòu)，還將釉質(zhì)的機械性能，例如硬度、彈性模量、耐摩擦系數(shù)等，也恢復(fù)至正常釉質(zhì)水平[17]。

上述研究使得釉質(zhì)再礦化修復(fù)領(lǐng)域取得了突破性進展，牙齒修復(fù)方法也將向更微創(chuàng)、修復(fù)效果更佳的方向行進。

2.1.2 牙本質(zhì)再礦化 當(dāng)齲壞發(fā)展突破釉質(zhì)，進入牙本質(zhì)層后，患者將出現(xiàn)明顯臨床癥狀。且牙本質(zhì)暴露后，食物殘渣、細菌及其代謝產(chǎn)物易侵入牙本質(zhì)內(nèi)部，難以清理。針對牙本質(zhì)齲，目前材料粘接充填是唯一的治療方法。但在傳統(tǒng)牙本質(zhì)粘接體系中，酸蝕過程會使牙本質(zhì)膠原纖維內(nèi)外的礦物質(zhì)同時喪失，引起牙本質(zhì)網(wǎng)塌陷，導(dǎo)致樹脂無法滲入纖維內(nèi)部，形成界面滲漏。并且脫礦膠原更易在膠原酶的作用下發(fā)生降解，進一步導(dǎo)致粘接界面退變。因此，牙本質(zhì)粘接的長期有效性面臨著嚴峻考驗。若能克服這一難題，牙本質(zhì)齲的修復(fù)將取得重大突破。在此方向，研究者們通過仿生礦化進行牙本質(zhì)仿生修復(fù)，以期重構(gòu)牙本質(zhì)并增強其耐酶解作用，從而達到提高樹脂牙本質(zhì)粘接耐久性的目的。

在牙本質(zhì)礦化過程中，非膠原蛋白（non-col‐lagenous proteins，NCP）起到至關(guān)重要的作用，可穩(wěn)定ACP 并誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化。故學(xué)者們由此入手，使用NCP 的仿生類似物，如牙本質(zhì)磷蛋白模擬肽、聚天冬氨酸等聚陰離子，穩(wěn)定鈣磷離子形成ACP，或直接使用ACP 回填到脫礦的牙本質(zhì)膠原中，完成牙本質(zhì)的再礦化[18-19]。利用上述技術(shù)，成功地實現(xiàn)了樹脂粘接界面脫礦牙本質(zhì)及齲壞脫礦牙本質(zhì)中裸露膠原的再礦化，不僅提高了樹脂牙本質(zhì)粘接界面的機械性能，還有效防止了膠原的降解和繼發(fā)齲的發(fā)生。并且，這種具備牙本質(zhì)再礦化性能的粘接劑粘接強度同市售粘接劑相當(dāng)[18,20]。同時，利用納米介孔硅控釋系統(tǒng)作為液相礦化前體的載體[21]，將其作為納米填料添加于粘接劑中，使得礦化前體在裸露膠原區(qū)原位緩慢釋放，促進了粘接界面再礦化。該復(fù)合材料的應(yīng)用可有效地阻斷牙本質(zhì)小管，抗酸穩(wěn)定性好，且不影響牙本質(zhì)與自粘接系統(tǒng)之間的即時粘結(jié)強度。該技術(shù)解決了仿生鈣化技術(shù)應(yīng)用中液相礦化前體原位輸送困難的問題，進一步推進了牙本質(zhì)再礦化修復(fù)的臨床轉(zhuǎn)化[22]。

雖然釉質(zhì)及牙本質(zhì)仿生礦化修復(fù)已取得巨大進展，如表1、2 所示。然而目前，各研究組使用的牙體組織再礦化研究模型多為牙齒磨片而非整顆牙齒，那么上述技術(shù)對牙齒整體的再礦化效果如何？并且口腔環(huán)境復(fù)雜，存在大量細菌及生物膜，是否會對影響材料對牙體組織的再礦化效果？后續(xù)的牙體硬組織仿生礦化實驗研究應(yīng)更加關(guān)注臨床效果，推進從實驗室到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化進程。

2.2 骨組織仿生修復(fù)

頜面部骨組織承擔(dān)著多項重要生理功能，然而創(chuàng)傷、腫瘤、炎癥等因素常導(dǎo)致頜面部骨組織缺損。骨缺損修復(fù)效果最佳的方法是自體骨移植，但存在來源有限、手術(shù)痛苦大等問題。而異體骨移植又存在排異反應(yīng)和細菌、病毒感染等風(fēng)險。因此，人工合成的骨修復(fù)材料或?qū)⑹俏磥淼呐R床發(fā)展趨勢。雖然目前臨床上人工合成材料來源廣泛，但存在生物活性和機械性能較差、血管化程度低、與機體整合速度慢、成骨性能不足等問題，難以獲得滿意的臨床療效[25]。歸根究底是因為這些材料的仿生度較差，只模擬了骨組織的基本成分，而未能準確模擬骨組織的微觀和宏觀結(jié)構(gòu)特征。如何同時實現(xiàn)骨修復(fù)材料在結(jié)構(gòu)和功能上的仿生，是骨缺損修復(fù)領(lǐng)域亟待解決的難題。

表1 釉質(zhì)再礦化修復(fù)總結(jié)Tab 1 Remineralization of enamel

表2 牙本質(zhì)再礦化修復(fù)總結(jié)Tab 2 Remineralization of dentin

2.2.1 結(jié)構(gòu)仿生 天然骨組織是一種具備高度有序納米結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與宏觀結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的無機-有機復(fù)合材料。理想的骨缺損修復(fù)材料，應(yīng)具備與骨相似的結(jié)構(gòu)特性。Hu 等[26]模擬骨組織的有機-無機組成，合成了細菌纖維素/HAP 納米復(fù)合材料。該復(fù)合材料既具備HAP 的生物相容性又具備纖維素優(yōu)良的機械性能，與天然骨的性能相接近。學(xué)者[27-29]在體外通過聚陰、陽離子穩(wěn)定礦化前體，成功構(gòu)建出纖維內(nèi)仿生硅化、鈣化及雜化材料，同時模擬了天然骨組織的納米結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)，在不同類型的骨缺損模型中均顯示出良好的修復(fù)效果，且該仿生礦化材料可釋放活性成分，并通過調(diào)控單核細胞的分泌功能促進成骨成血管過程的耦合，從而加速骨缺損的修復(fù)。

然而上述材料一般為在體外構(gòu)筑礦化好后，再移植到體內(nèi)進行骨修復(fù)，在此過程中存在材料脆性較大不易塑形等問題。為解決這一難題，學(xué)者[30]從礦化前體入手，利用磷酸鈣聚合物液態(tài)前體納米簇，進行骨缺損的修復(fù)。這種液相前體呈粘稠狀態(tài)，具有流動性等特點，可以注射到局部。將其注射到骨質(zhì)疏松的骨腔，可完全修復(fù)疏松的骨組織。傳統(tǒng)仿生礦化策略常在鈣磷溶液中添加大量聚陰離子以模擬NCP，從而達到穩(wěn)定鈣磷離子形成無定形礦化前體的效果。然而這種額外添加聚電解質(zhì)的方式在體內(nèi)應(yīng)用中難以實現(xiàn)，且大量游離的陰離子會對周圍組織產(chǎn)生毒性，其生物相容性差成為了臨床轉(zhuǎn)化的又一大難題?；诖?，學(xué)者[31]模擬非膠原蛋白與膠原纖維間的關(guān)系，直接將高分子量聚丙烯酸交聯(lián)于膠原上，其所誘導(dǎo)出的礦化效果可與傳統(tǒng)仿生礦化策略相媲美，且交聯(lián)后的膠原韌性好，生物相容性更佳，同時解決了材料不易塑形、聚電解質(zhì)原位輸送困難、組織相容性差這三大問題。

2.2.2 功能仿生 骨組織礦化形成的過程需要多種細胞共同參與，因此學(xué)者們在支架材料上引入生物活性物質(zhì)，構(gòu)建出功能仿生的骨修復(fù)材料，可刺激成骨微環(huán)境，達到加速骨組織礦化修復(fù)的目的。

諸多學(xué)者采用微小RNA 緩釋遞送系統(tǒng)實現(xiàn)了仿生骨修復(fù)材料的成骨功能強化。例如通過將RNA、納米多聚物微球附著在無細胞的納米纖維聚合物支架上，在空間上控制miR-26a的釋放，并進一步通過靶向激活內(nèi)源性干細胞的成骨活性，在不依賴外源性細胞的條件下有效解決大面積骨缺損與骨質(zhì)疏松骨缺損修復(fù)的難題[32]。以外泌體為基礎(chǔ)構(gòu)建無細胞組織工程化骨，通過加載含有生物抗炎因子和miR-10a的納米微球，同時實現(xiàn)了抗炎與骨再生，在小鼠牙周炎模型中取得了良好成效[33]。這種加載了生物活性分子的功能性骨修復(fù)材料，可以明顯縮短成骨時間并同時提高骨再生質(zhì)量，為攻克多項骨缺損修復(fù)難題提供了思路。

新骨再生常與神經(jīng)血管的再生并行，因此，促成血管化和成神經(jīng)化在骨缺損的功能性修復(fù)中至關(guān)重要。在骨缺損修復(fù)材料的促成血管改性方面，學(xué)者[34-35]提出了使用孔道/多孔復(fù)合結(jié)構(gòu)支架材料預(yù)植內(nèi)皮細胞共同實現(xiàn)大塊支架“整體快速血管化”的設(shè)計思路，其創(chuàng)建的細胞與因子復(fù)合微組織的磁場精確控制構(gòu)建技術(shù)，可顯著提高功能化骨缺損修復(fù)材料的血管化骨再生效果。另外。該團隊[36]還利用多種生物活性因子，對骨缺損修復(fù)材料進行修飾，提高了材料的骨誘導(dǎo)活性。并且構(gòu)建出的可注射功能化蠶絲水凝膠既具備良好的生物降解性，又具備優(yōu)良的促血管和成骨性能，可用于不規(guī)則骨腔的修復(fù)[37]。此外，通過梯度孔徑、摻鍶、低氧誘導(dǎo)等促進材料血管化，利用神經(jīng)營養(yǎng)因子、miR-222等促進材料神經(jīng)化，構(gòu)建出了功能性組織工程骨，在骨缺損修復(fù)效果上取得卓越成效[38]。通過上述學(xué)者的研究，構(gòu)建出了高活性、功能仿生的骨修復(fù)材料，為加速頜面部骨修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。

雖然上述兩種骨組織的仿生修復(fù)策略都取得了良好的修復(fù)效果（表3），但二者都存在著相應(yīng)的問題。首先，結(jié)構(gòu)仿生的骨修復(fù)材料制備時常需采用聚電解質(zhì)等化合物，其生物相容性及生物誘導(dǎo)性同生物活性物質(zhì)相比略有不足。而功能仿生的骨修復(fù)材料常需要生物活性物質(zhì)的加入，其制備復(fù)雜，成本較高，不易儲存及商品化生產(chǎn)。若能結(jié)合二者優(yōu)勢，找到一種生物體內(nèi)存在、易于大量生產(chǎn)、且可增強修復(fù)材料成骨性能的物質(zhì)，將會為骨缺損修復(fù)材料的研發(fā)帶來重大突破。值得注意的是，頜面部骨組織承重少，形態(tài)多樣，需要個性化的修復(fù)。3D 打印為材料的形狀塑造提供了良好的技術(shù)支撐，上述結(jié)構(gòu)仿生及功能仿生的骨修復(fù)理念可與3D 打印技術(shù)結(jié)合起來，為患者提供個性化的頜面骨修復(fù)材料[39]。但目前對上述骨缺損修復(fù)材料構(gòu)建時，通常先通過3D 打印，打印出支架，之后再對支架進行相應(yīng)的修飾，操作繁瑣，耗時較長。如何在打印骨修復(fù)材料支架的同時對其進行修飾，將“兩步走”合為“一步走”，減少材料生產(chǎn)周期，這需要我們進一步探索。

表3 骨組織的仿生修復(fù)總結(jié)Tab 3 Biomimetic restoration of bone defect

3 結(jié)論與展望

口腔頜面部硬組織缺損會對患者造成心理及生理上不可估量的傷害，為響應(yīng)“健康中國”的號召，解決好硬組織缺損修復(fù)這一難題對國民健康至關(guān)重要。由于硬組織本身是自然生物礦化的產(chǎn)物，所以從生物礦化過程中入手，衍生出仿生礦化技術(shù)，并形成材料、理論反作用于生物礦化體系，是實現(xiàn)口腔頜面部硬組織缺損修復(fù)的理想途徑。近些年來，隨著礦化理論的發(fā)展，形成了很多新技術(shù)，在硬組織修復(fù)領(lǐng)域取得了重要突破，然而大部分研究仍局限于體外階段。隨著對礦化機制更全面深入的認識，仿生理論從體外化學(xué)物質(zhì)走向體內(nèi)生物體系的轉(zhuǎn)化步伐也會逐漸加快。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。