蘆筍-杏鮑菇發酵型飲料制備與組分檢測*

劉 飛，王黎明，董玉瑋**，王克勤，周天宇，陳學紅，苗敬芝

（1.徐州康匯百年食品有限公司，江蘇 徐州 221743；2.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018）

隨著生活水平的提高，消費者對飲料的喜好和需求發生了巨大的變化，近幾年具有營養兼保健功能的飲料，銷售量大幅度增長，但這類飲料中，對人體健康有益的發酵飲料、食用菌飲料占比較小，并且食用菌飲料中又有相當一部分直接采用子實體為原料生產，無法最大限度的發揮食用菌的營養和功能。采用深層發酵技術生產食用菌飲料，能很好的保留食用菌的功效[1]，同時原料中部分成分被降解，形成許多新的營養和保健成分及新的風味物質，是其他飲料所無法比擬和代替的，因此開發新型發酵型食（藥） 用菌飲料的發展前景廣闊。

蘆筍（Asparagus officinalis L.），屬于百合科（Liliaceae） 天門冬屬（Asparagus），富含蛋白質、礦物質等營養成分[2]，還含有多酚、皂苷、多糖等功能成分[3]，具有抗癌[4]、抗衰老、抗紫外線[5]等作用。蘆筍根莖中含有大量木質素、纖維素[6]，略影響其口感。杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側耳，因具有杏仁香味和鮑魚口感而得名，隸屬擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌目 （Agaricales） 側耳科（Pleurotaceae） 側耳屬 （Pleurotus）[7]。杏鮑菇富含高蛋白、人體必需的各種氨基酸[8]和豐富的生物活性物質，如多糖、脂類、多肽、三萜類化合物等[9]，具有降血糖、降血脂、增強人體免疫力、美容養顏等功效[10]。杏鮑菇具有分解、利用纖維素、木質素的能力[11]，同時蘆筍根莖中含有的蛋白質、維生素、礦物質等營養成分[12]也可作為食（藥） 真菌生長的原料。因此以蘆筍根莖為液體培養基，液體發酵食用菌生產飲料，融合了真菌和植物營養的成分，具有天然綠色、健康、原料成本低等優勢，提升了飲料的價值，有利于擴大發酵型飲料市場，具有較好的開發潛力和市場應用價值[13]。

以蘆筍為主要原料，杏鮑菇為發酵菌種，采用液體深層發酵技術，制備蘆筍-杏鮑菇發酵型飲料，充分利用了杏鮑菇自身營養，并結合蘆筍的營養成分，形成了獨特的營養價值，為提升蘆筍和杏鮑菇的深加工提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料和試劑

蘆筍，由徐州山崎農產品技術研發有限公司提供；杏鮑菇為實驗室保存的高活性杏鮑菇菌種；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、黃原膠、β-環狀糊精、檸檬酸購于河南經斯達食品添加劑有限公司；蜂蜜產于河南長生園蜂業有限公司；單糖、氨基酸標準品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等）、乙腈（色譜純）購于國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純購于天津市恒興化學試劑股份有限公司。

1.1.2 試驗儀器

DNP-9096電熱恒溫培養箱，蘇州威爾實驗用品有限公司；HH-1電熱恒溫水浴鍋，常州蒙特儀器制造有限公司；XFH-40MA高壓蒸汽滅菌鍋，上海坤天實驗室儀器有限公司；GZX-DH.730-Ⅱ電熱恒溫干燥箱，深圳市哈賽科技有限公司；QOP-205E/B冷藏冷凍箱，上海雙旭電子有限公司；7230G可見分光光度計，上海雙旭電子有限公司；80-1低速離心機，常州金壇三和儀器有限公司；JA7603N電子天平，河北雙鑫試驗儀器制造有限公司；1260液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 培養基

1.2.1 液體發酵培養基

將蘆筍洗凈并用粉碎機粉碎，稱取6.3%的鮮蘆筍倒入500 mL三角瓶中，加入3.5%的酵母膏及250 mL純水，封口滅菌。

1.2.2 斜面培養基

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基：按照GB 4789.15-2010食品衛生微生物學檢驗霉菌和酵母計數的方法配制培養基[14]，用于菌種的復蘇及保存。

1.3 菌種活化與發酵

在無菌操作臺內將杏鮑菇菌種接入斜面培養基中，28℃培養箱培養6 d～8 d。挑選長勢較好菌種，接種于蘆筍液體發酵培養基中，28℃、120 r·min-1搖床培養7 d～9 d。

1.4 穩定劑單因素試驗

將發酵液研磨后裝入離心管中離心。4 000 r·min-1離心機離心10 min，取上清液。單因素試驗重復3次，取平均值。

1.4.1 黃原膠的添加量

在裝有上清液的離心管中分別加入0.04%、0.05%、0.06%、0.07%和0.08%的黃原膠，靜置12 h以上，計算穩定系數。

1.4.2 羧甲基纖維素鈉的添加量

在裝有上清液的離心管中分別加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的羧甲基纖維素鈉，靜置12 h以上，計算穩定系數。

1.4.3 β-環狀糊精的添加量

在裝有上清液的離心管中分別加入0.20%、0.30%、0.40%、0.50%和0.60%的β-環狀糊精，靜置12 h以上，計算穩定系數。

1.4.4 穩定性測量

將杏鮑菇發酵液于離心機3 000 r·min-1離心10 min，在750 nm下測定吸光度，計算穩定性系數R。R值越大，表示懸浮粒子在發酵液中的沉降速度越小，飲料越穩定[15]，其計算公式為：

式中：A1為離心前的吸光度值；A2為離心后的吸光度值。

1.5 穩定劑正交試驗

將飲料使用的β-環狀糊精、黃原膠、羧甲基纖維素鈉幾種穩定劑用L9（34）正交表進行設計試驗，根據正交表確定試驗內容，得到主次影響因素。

1.6 調配劑單因素試驗

在飲料中分別加入1%、1.5%、2%、2.5%和3%的蜂蜜，溶解均勻后品嘗并打分；在飲料中分別加入6%、7%、8%、9%和10%的蔗糖，溶解均勻后品嘗并打分；在飲料中分別加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的檸檬酸，溶解均勻后品嘗并打分。單因素試驗均重復3次，取平均值。

1.7 調配劑響應面試驗設計

在單因素實驗后，取最優結果及附近的一共3組數據使用Design-Expert 8軟件，設計方案，并進行試驗。因素水平見表1。

表1 試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of experiment

1.8 飲料的感官評定

飲料的感官評定會從甜度、酸度、香味、色澤給出結果。隨機邀請15位具有一定食品感官評定基礎的專業人員進行品嘗，打出分數，每次品嘗前都用溫水漱口。感官評分標準見表2。

表2 飲料感官評分標準Tab.2 Sensory evaluation criteria for beverages

綜合感官評價分值（W，分）計算公式為：

式中：a為甜度分滿分25分；b為酸度分滿分25分；c為香味分滿分25分；d為色澤分滿分25分。

1.9 多糖的提取和測定

1.9.1 粗多糖的提取

將制備后的飲料4 000 r·min-1離心10 min，取上清置于50℃烘箱中烘至原體積1/5，再加入5倍體積95%乙醇，4℃冰箱中過夜醇沉后，4 000 r·min-1離心5min，取沉淀于50℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.9.2 粗多糖純化

粗多糖采用Sevag法脫蛋白[16]。將1 g粗多糖加入10 mL純水溶解，加入2.5 mL Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），將混合溶液裝入分液漏斗中震蕩18 min～20 min，取上層溶液 4 000 r·min-1離心 15 min，棄下層液體，上清液重復上述操作，至無蛋白質層，合并上清液備用。取截流分子量為6 000 kDa～8 000 kDa的半透膜袋，沸水水浴5 min，純水將其沖開，封住一端，將上述所得上清液倒入后封住開口另一端，置于裝有純水的燒杯中，用磁力攪拌器透析，每隔2 h換1次水，2 d后烘干即為精制多糖。

1.9.3 多糖測定

將1 g粗多糖加入100 mL蒸餾水充分溶解，取2 mL多糖溶液，加1 mL 6%苯酚，5 mL濃硫酸，混勻，100℃水浴15 min，冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度值，對照組為蒸餾水。經標準曲線計算多糖含量。

1.9.4 葡萄糖標準曲線制作

將40 g葡萄糖放入500 mL的燒杯中，加蒸餾水定容。分別吸取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL 的葡萄糖溶液于試管中，并編號為1～9，加蒸餾水定容到2.0 mL，再在試管中加入1 mL 6%的苯酚溶液與5 mL的濃硫酸，充分混勻后放入100℃水浴鍋中水浴15 min，冷卻后于波長490 nm處測量各個試管中溶液的吸光度值。

1.10 高效液相色譜法檢測單糖和氨基酸組分

稱取適量多糖樣品，加入2 mol·L-1三氯乙酸溶液0.5 mL，在116℃水解100 min，吹干。試管中加入5 μL單糖標準品，加入2 mol·L-1三氯乙酸溶液0.5 mL，在116℃下水解100 min，吹干。在處理后的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol·L-1的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 試劑和0.3 mol·L-1的NaOH溶液各0.5 mL，68℃水浴28 min。冷卻后，加入0.3 mol·L-1HCl 0.5 mL。加入0.5 mL氯仿，充分震蕩萃取后，5 000 r·min-1離心5 min去除氯仿層。水層用0.22 μm濾膜過濾。色譜柱為SHISEIDO C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫 25℃，波長為245 nm，流動相為0.1 mol·L-1pH 6.8磷酸鹽緩沖液 ∶乙腈為 82∶18 （v/v），流速為 1.0 mL·min-1，進樣量 10 μL。

HPLC檢測氨基酸：樣品中加入20 mL鹽酸后，干燥，110℃水解，降溫，比色管中定容。取1 mL在85℃下氮氣流吹干。加入10 mL 0.02 mol·L-1鹽酸，震蕩。分取 500 μL，加 250 μL 0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯乙腈和250 μL 1 mol·L-1三乙胺乙腈，衍生1 h。加2 mL正己烷，震蕩，靜置，取下層，過0.45 μm有機膜上機。色譜柱為SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為 A：0.1 mol·L-1無水乙酸 ∶乙腈為97∶3（調pH 6.5）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫 40℃；進樣量 10 μL，波長為 245 nm。采用外標法對飲料樣品的高效液相色譜圖中各氨基酸的峰面積進行積分測定氨基酸種類，并計算質量百分比。

1.11 微生物檢測

按照GB 4789.2-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定方法進行菌落總數測定[17]，按照GB 4789.3-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數方法對進行大腸桿菌計數[18]，按照GB 29921-2013食品安全國家標準食品中致病菌限量標準進行致病菌檢測[19]。

1.12 數據分析

所有數據均采用表示，用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 穩定劑的單因素實驗

2.1.1 黃原膠添加量的確定

黃原膠添加量變化時，發酵液的穩定性結果見圖1。

圖1 黃原膠添加量不同時發酵液的穩定系數Fig.1 Stability coefficient of fermentation broth with different xanthan gum addition

如圖1所示，當黃原膠的添加量在0.06%時，飲料穩定系數最大，為93.4%，因此選擇添加黃原膠的量為0.06%。張政等[20]制備靈芝—蜂花粉—蜂蜜的液體發酵飲料時，黃原膠添加量在0.05%～0.15%，與上述測定結果基本一致。

2.1.2 羧甲基纖維素鈉添加劑的確定

羧甲基纖維素鈉添加量變化時，發酵液的穩定性結果見圖2。

圖2 羧甲基纖維素鈉添加量不同時發酵液的穩定系數Fig.2 Stability coefficient of fermentation broth with different amount of sodium carboxymethyl cellulose

如圖2所示，當羧甲基纖維素鈉的添加量在0.15%時，飲料穩定系數最大，為92.2%，因此確定其添加量為0.15%。黃梅華[21]等以火龍果皮為原料，用乳酸菌發酵后制作飲料，羧甲基纖維素鈉的添加量為0.06%～0.12%，在0.12%時飲料最穩定，與上述測定結果基本一致。

2.1.3 β-環狀糊精添加量的確定

β-環狀糊精添加量變化時，發酵液的穩定性結果見圖3。

圖3 β-環狀糊精添加量不同時發酵液的穩定系數Fig.3 Stability coefficient of fermentation broth with different addition of β-cyclodextrin

如圖3所示，當β-環狀糊精的添加量在0.4%時，飲料穩定系數最大，為91.2%，所以選擇添加β-環狀糊精的量為0.4%。王丹[22]在對發酵型牡蠣飲料研究時發現，添加2.5%β-環狀糊精時飲料最穩定。

2.2 穩定劑正交試驗

為了確定試驗穩定劑黃原膠（A）、羧甲基纖維素鈉（B）、β-環狀糊精（C） 的最佳用量，水平分析見表3，根據正交表進行試驗獲得數據見表4。

表3 穩定劑添加量水平表Tab.3 Stabilizer addition level table

表4 穩定劑正交表Tab.4 Orthogonal table of stabilizers

由表4可知，對比極差項R，B＞A＞C，即羧甲基纖維素鈉對發酵液穩定性影響最大，其次是黃原膠，最后是β-環狀糊精。正交試驗得出最優組合是B2A2C2，即0.15%羧甲基纖維素鈉，0.06%黃原膠，0.4%β-環狀糊精。通過驗證，在最優組合下發酵液的穩定系數為91.2%。

2.3 調配劑的單因素試驗

2.3.1 蜂蜜添加量

在蜂蜜添加量不同時，飲料的感官評分結果見圖4。

圖4 不同蜂蜜添加量條件下的評分結果Fig.4 Evaluation results of different honey addition

由圖4可知，當蜂蜜的添加量為1.5%時評分最高，為94分。因此選擇1.0%、1.5%和2.0%的蜂蜜添加量為作為響應面的試驗數據。董玉瑋[23]等在制備靈芝、金針菇發酵型飲料時，蜂蜜的添加量是1.0%～2.0%，在1.5%時，飲料獲得最好的口感，與上述試驗結果相近。

2.3.2 蔗糖添加量

飲料在蔗糖添加量不同時，感官評分結果見圖5。

圖5 不同蔗糖添加量條件下的評分結果Fig.5 Scoring results under different sucrose addition

從圖5可知，當蔗糖添加量為7%時評分最高，為95分。因此選擇6%、7%和8%的蔗糖添加量為作為響應面的試驗數據。冉景盛[24]等制備靈芝發酵飲料時，蔗糖添加量為6%～12%，與試驗結果相似。

2.3.3 檸檬酸添加量

飲料在檸檬酸添加量不同時，感官評分結果見圖6。

圖6 不同檸檬酸添加量條件下的評分結果Fig.6 Scoring results under different citric acid addition

從圖6可知，當檸檬酸添加量為0.15%時評分最高，為93分。因此選擇0.10%，0.15%和0.20%的檸檬酸添加量為作為響應面的試驗數據。趙磊等[25]對植物乳桿菌發酵紫薯飲料研究時發現，檸檬酸的添加量為0.1%～0.2%，0.1%時口感最好，接近試驗的添加量。

2.4 響應面試驗設計

通過響應面軟件給出的17種條件進行試驗，得到的感官評分結果見表5。

表5 響應面分析方案與結果Tab.5 Response surface methodology and results

從表5可以看出，當蜂蜜（X1） 添加量為1.5%、蔗糖（X2） 添加量為7%、檸檬酸（X3） 添加量為0.15%時，感官評分最高，為93.09分，應將此范圍作為最佳響應區域。

2.5 回歸模型的建立和檢驗

對蜂蜜（X1）、蔗糖（X2） 檸檬酸（X3） 3單因素進行回歸擬合，回歸方程為：

其具體統計分析結果如表6所示。

表6 回歸模型方差分析Tab.6 Analysis of variance in regression model

回歸模型達到了極顯著水平；失擬項 P值＞0.05，影響不顯著，試驗無失擬因素存在，能充分反映實際情況；決定系數R2為0.991 6，說明實際結果與模型預測結果的一致性良好；R2adj=0.980 8，試驗結果有98.08%受試驗因素影響。該模型擬合程度好，可以用該模型對蘆筍-杏鮑菇發酵型飲料制備工藝進行分析和預測。由回歸方程和方差分析可知，模型中X2、X1X2、X1X3對蘆筍-杏鮑菇發酵型飲料感官評分的影響為極顯著，X1、X3對蘆筍-杏鮑菇發酵型飲料感官評分的影響為顯著。各因素對感官評分的影響依次為 X2＞X1＞X3，即蔗糖＞蜂蜜＞檸檬酸。

2.6 兩因素間交互作用分析

各因素間的交互作用分析見圖7。

圖7 響應面分析圖和等高線圖Fig.7 Response surface analysis chart and contour map

由圖7a可知，蔗糖添加量與檸檬酸添加量的交互作用最顯著，蔗糖添加量對試驗結果影響的顯著性大于檸檬酸添加量。由圖7b可知，蜂蜜添加量與檸檬酸添加量的交互作用較顯著，且蜂蜜添加量影響的顯著性大于檸檬酸添加量。由圖7c可知，蔗糖添加量與檸檬酸添加量的交互作用不顯著。比較3組圖可知，蔗糖添加量對感官評分結果的影響最顯著，表現為曲線較陡，蜂蜜添加量、檸檬酸添加量的影響較顯著，表現為曲線較平滑。3因素對感官評分結果的影響及各個因素間的交互影響與回歸分析結果吻合。

2.7 調味劑最優分析和結果驗證

回歸模型確定的最佳制備工藝為蜂蜜、蔗糖、檸檬酸的最佳添加量分別為1.34%、7.06%、0.15%，此條件下對飲料最高的感官評分是93.22分。為了驗證此最佳方案，按該最優調味劑添加量進行后續的驗證試驗，重復3次，試驗結果取平均值，得到評分結果為92.74分。與響應面分析結果很接近，說明該模型具有較高可靠性。

2.8 飲料成品衛生指標檢測

檢測得到菌落總數95 CFU·mL-1，未檢出大腸桿菌和致病菌，符合國家食品生產衛生標準。

2.9 蘆筍-靈芝發酵型飲料營養成分的檢測

2.9.1 多糖紅外光譜檢測結果

飲料多糖的紅外光譜檢測圖見圖8。

從圖8可知，蘆筍-杏鮑菇發酵型飲料多糖具有典型的多糖特征吸收峰，3 422 cm-1處有強的-OH伸縮振動吸收峰，1 631 cm-1處為酰胺基的振動吸收峰，2 925 cm-1、1 419 cm-1、1 263 cm-1處有-CH3、-CH2、-CH等的-CH變角振動吸收峰，1 349 cm-1為-OH變角振動吸收峰，1 218 cm-1處有-COOH中-OH變角振動吸收峰，1 127 cm-1有吡喃糖環醚鍵中的C-O伸縮振動，1 031 cm-1處的則是醇羥基的變角振動吸收峰，1 097 cm-1和1 031 cm-1分別代表C=O的環醚C-O-C伸縮振動和C-O-H的-OH可變角振動，803 cm-1處是甘露糖的振動吸收峰。綜合后可推斷，飲料多糖是吡喃型多糖類化合物。

圖8 飲料多糖紅外光譜檢測圖Fig.8 Infrared spectra of beverage polysaccharide

2.9.2 多糖中單糖組分的檢測

標準曲線回歸方程（R2=0.990 2）為：

最佳工藝制備的飲料，含有杏鮑菇多糖1.74 mg·mL-1。多糖中單糖組分色譜圖見圖9。

圖9 飲料多糖中單糖組分的高效液相色譜圖Fig.9 High performance liquid chromatography of monosaccharide components in beverage polysaccharide

由圖9可知，飲料多糖單糖組分包含甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。羅懿洋等[26]研究了杏鮑菇多糖中單糖的組成分析是甘露糖、核糖、鼠李糖、葡糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖和巖藻糖，與本結果相比多了核糖和巖藻糖。伍善廣等[27]采用高效液相色譜法檢測獲得杏鮑菇多糖的單糖組成為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，與本結果相比多了核糖、鼠李糖、和巖藻糖。可能原因是杏鮑菇分解了蘆筍中的纖維素、木質素，利用其作為碳源，重組了多糖組分。該飲料中單糖的組分含量見圖10。

圖10 單糖組分含量結果Fig.10 Monosaccharide content results

通過圖10可知，飲料多糖的單糖組分含量中，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖含量較高，其中葡萄糖的含量最高，為33 285.26 mg·kg-1。羅懿洋等[26]研究表明杏鮑菇多糖中葡萄糖、甘露糖與半乳糖含量較高，葡萄糖含量最高，伍善廣等[27]研究結果中，發現杏鮑菇多糖中葡萄糖含量占比也最大，與研究結果基本一致。

2.9.3 氨基酸組分測定

氨基酸組分高效液相色譜圖見圖11，其基本組分見圖12。

圖11 氨基酸組分高效液相色譜圖Fig.11 High performance liquid chromatography of amino acids

圖12 飲料中氨基酸組分Fig.12 Amino acids in beverages

由圖11及圖12可知，飲料中富含天冬氨酸、胱氨酸、甘氨酸等17種氨基酸。其中脯氨酸含量最高，為914.57 mg·kg-1，必需氨基酸與氨基酸總量比值為27.60%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為38.12%，天冬氨酸和谷氨酸2種呈鮮味氨基酸含量占25.67%，9種藥效氨基酸含量高達58.07%，說明制備的蘆筍-杏鮑菇發酵型飲料口感鮮美，營養價值高，具有良好的營養和保健功效。

3 結論

通過單因素試驗，3種穩定劑的最佳配方為黃原膠為0.06%，羧甲基纖維素鈉為0.15%，β-環狀糊精為0.4%。調味劑單因素和響應面試驗確定最佳配方為蜂蜜1.34%，蔗糖7.06%，檸檬酸0.15%，此時飲料感官鑒評評分最高，為93.22分；每兩個因素間的交互作用對飲料口感影響的大小為：蔗糖和檸檬酸＞蜂蜜和檸檬酸＞蜂蜜和蔗糖，未檢測出大腸桿菌和致病菌，符合國家食品安全標準。

飲料多糖的提取含量為1.74 mg·mL-1。經高效液相色譜分析得出杏鮑菇多糖中的單糖成分有甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，其中葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖含量較高。氨基酸組成為天冬氨酸、胱氨酸、甘氨酸等17種，其中脯氨酸含量最高，為914.57 mg·kg-1。