遼寧省野生羊肚菌資源調查與遺傳多樣性分析*

王 紅 ，曹 君 ，張 敏 ，張士義 ，張季軍 ，劉俊杰 ，楊 鎮 ，呂立濤 **

（1.遼寧省農業科學院食用菌研究所，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧省食用菌優質栽培重點實驗室，遼寧 沈陽 110161）

羊肚菌屬（Morchella Dill.ex Pers.:Fr.），隸屬于子囊菌門（Ascomycata） 盤菌亞門（Pezizomycotina）盤菌綱（Pezizomycetes） 盤菌目（Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae）[1]，因其菌蓋有不規則的凹陷褶皺，狀如羊肚而得名，是一種珍貴的食（藥）用真菌。自羊肚菌屬建立以來，科研人員針對其生態分布、分類鑒定、菌種保育及栽培技術等開展了大量的研究。羊肚菌在亞洲、歐洲、北美洲等均有分布[2-5]。目前，已記錄羊肚菌種和變種的數據多達344個[6]，其中中國分布有羊肚菌30種[7]，以溫帶落葉闊葉林、高海拔暗針葉林及針闊混合林為羊肚菌的主要植被生境[8-9]。羊肚菌主要在3月～5月出菇[2]，僅有少數物種在7月及9月～10月出菇[8，10]。

根據傳統的形態學分類方法，羊肚菌分為黃色羊肚菌（yellow morels）、黑色羊肚菌（black morels）和半開羊肚菌（semifree capped moerls），而發育過程中，其形態特征會受到環境的影響，且物種間宏觀顯微特征有限，會引起同物異名和同名異物的現象[11-14]。2000年，Taylor等[15]提出了多基因系譜一致性系統發育種識別法（genealogical concordance phylogenetic species recognition，GCPSR），為羊肚菌精準分類提供了方向。2011年，O’Donnell等[16]首次利用GCPSR的方法，基于ef1-α、LSU、rpb1和rpb2的核苷酸序列，將羊肚菌分為Elata Clade（黑色羊肚菌支系）、Esculenta Clade（黃色羊肚菌支系） 和Rufobrunnea Clade（變紅羊肚菌支系）。目前，國內外已有許多地區采用GCPSR對羊肚菌資源進行系統分類的報道[17-22]，以從分子系統分類學角度，糾正或彌補羊肚菌分類上的錯誤和不足。

1987年開始，郭浩等[23]對遼寧省陸續進行實地考察，對野生羊肚菌的生態分布、分類鑒定、馴化栽培等進行了研究。而野生資源分類鑒定方面，僅根據形態特征分類[23-25]，除本課題組對遼寧省康平地區羊肚菌資源[26-27]及羊肚菌多基因序列模標數據庫（Morchella MLST database）[28]中涉及的遼寧省沈陽市和丹東市兩個采樣點采用分子生物學的方法進行分類鑒定外，未見依據分子生物學標記專門針對遼寧省野生羊肚菌進行分類鑒定的報道。

通過調查遼寧省的羊肚菌資源及其發生環境，確定其種屬關系，探索其發生的適宜條件，旨在確定遼寧省擁有的羊肚菌種質資源，為遼寧省野生羊肚菌的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

根據文獻記載[23-25]及實地調研，遼寧省野生羊肚菌主要分布在遼寧省東部山區和遼西的大凌河流域，出菇時間在每年的4月初～5月末，通常分布在楊樹林或楊樹林緣草地、河灘草等地。

根據出菇特征，2016年～2018年，在遼寧省的沈陽市、撫順市、鞍山市、朝陽市、丹東市、本溪市、阜新市7個市布點采樣。3年間，共采集羊肚菌子實體53份，分布于16個羊肚菌發生地。樣品采集地點以楊樹林為主，分布在東部山區的羊肚菌多發生在楊樹林中，樹林中腐葉較多，土壤多為褐色粘質土壤；分布在大凌河流域的羊肚菌多發生在樹林緣草地、河灘草中，雜草叢生，土壤為黑褐色沙質土，在樹林附近有小溪或水溝。試驗采集樣品保存于遼寧省農業科學院食用菌研究所食用菌所，采集樣本信息見表1。

表1 羊肚菌子實體樣本采集信息及居群Tab.1 Collection information and populations of Morchella spp.samples collected

1.2 形態鑒定

將采集的子實體，參照《羊肚菌生物學與栽培技術》[29]按照子實體顏色、形狀和脊背等特征進行形態學分類，然后采用組織分離法獲得菌絲體進行顯微形態鑒定。

1.3 分子鑒定

1.3.1 總DNA提取

采用E.Z.N.A.TM Fungal DNA Kit試劑盒提取菌絲體的總DNA，將提取的總DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存備用。

1.3.2 ITS序列擴增

建立20 μL的PCR反應體系，其中2×Easy Taq Mix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板DNA 0.8 μL，ddH2O 補至 20 μL。

ITS-PCR擴增反應程序為95℃預變性4 min，95℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，30個循環，72℃延伸7 min。引物序列[29]見表2。

PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶測序。

1.3.3 多基因序列擴增

建立20 μL的PCR反應體系，其中2×Easy Taq Mix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，模板DNA 0.8 μL，ddH2O 補至 20 μL。

多基因擴增反應程序為94℃預變性3 min，94℃變性60 s，50℃退火30 s，72℃延伸 60 s，35個循環，72℃延伸10 min。引物序列見表2。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶測序。

表2 PCR引物序列Tab.2 PCR Primer sequences

1.4 ISSR序列分析

利用1.3.1提取的總DNA，建立15 μL的ISSRPCR反應體系，其中2×Easy Taq Mix 7.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.6 μL，模板DNA 0.6 μL，ddH2O補至15 μL。引物序列見表3。

表3 ISSR-PCR引物序列Tab.3 ISSR-PCR Primer

ISSR-PCR擴增反應程序為94℃預變性5 min，94℃變性 45 s，53℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，38個循環，72℃延伸10 min。

PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳90 min，電泳檢測，用凝膠成像儀記錄條帶數量及位置。

2 結果與分析

2.1 形態鑒定

不同地區羊肚菌子實體形態特征見圖1、圖2、表4。

表4 不同地區羊肚菌子實體的大小Tab.4 The size of Morchella spp.in different areas

圖1 不同發生地采集的羊肚菌Fig.1 Morchella spp.collected from different habitats

圖2 羊肚菌菌絲顯微結構Fig.2 Micromorphology of Morchella spp.

由圖1，圖2，表4可知，遼寧野生羊肚菌子實體偏小。子囊果4.9 cm～6.0 cm，菌蓋高2.88 cm～4.20 cm，最寬部位寬1.90 cm～3.30 cm，通常為圓錐形；主脊和橫脊交錯組成不規則的凹坑；子囊果為棕黃色至深褐色；菌蓋與菌柄合生；菌柄長0.8 cm～1.7 cm，寬0.4 cm～1.1 cm，近乎圓柱形；菌柄和菌肉同色，白色，中空。孢子橢圓型，表面光滑，孢子印深灰色。

2.2 分子鑒定

2.2.1 ITS分子鑒定

提取子實體總DNA，ITS序列擴增測序，通過羊肚菌多基因序列模標數據庫Morchella MLST[27]比對，53份樣本為黃色系羊肚菌。采用MEGE 7.0進化樹分析軟件，以黑色系羊肚菌Mel-10作為外群，采用Maximum Likelihood Tree法，構建系統發育樹見圖3。

由圖3可知，53份羊肚菌樣本，通過NCBI網站查詢比較，均歸類為Esculenta Clade。其中8X01～8X06、 8C04 ～8C19、 8C91、 7S02 ～7S06、 7C01 ～7C02、7C05～7C06、6F01～6F02、6S02，共 35 份樣本與Mes-6同為一種；8D01～8D04，共4份樣本與Mes-21為同一種；8B01～8B02，共2份樣本與 Mes-8 為同一種；8C01～8C03、8D05～8D08、6A01～6A02、6S01、 6S04～6S05，共 12 份樣本與Mes-20和Mes-9聚在一起，共分為4個區域。基于ITS序列構建的遼寧省野生羊肚菌系統發育樹無法將第4區域中的12份樣本完全區分開來。因此，還需要采用GCPSR法構建系統發育樹，明確其種間關系。

圖3 基于ITS序列構建的羊肚菌系統發育樹Fig.3 Phylogentic tree based on rDNA ITS sequence

2.2.2 系統發育樹構建

利用GCPSR的方法，基于ef1-α、LSU、rpb1和ITS這4個基因的核苷酸序列，對53份羊肚菌樣品進行了系統發育分析。多基因序列經逐一多重比對后，利用Sequencematrix進行多源數據合并，數據文件進行同質性檢驗（partition homogeneity test，PHT），采用ILD Test檢驗方法，P值為0.06，大于數據集可聯合的閾值0.05，表明4種基因序列可以聯合分析。采用最大簡約法（most parsimony tree，MP）構建系統發育樹，見圖4。

圖4 遼寧省黃色羊肚菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yellow morels in Liaoning province

由圖4可知，與ITS系統發育樹一致，但略有差異。GCPSR法，將與Mes-9和Mes-20聚在一起的 12 份樣本區分開來，8C01～8C03、8D05～8D08、6A01～6A02，9份樣本與Mes-20聚成一類，6S01、6S04～6S05，3份樣本與Mes-9聚成一類。而8D01～8D04被分成兩部分，8D01～8D02與Mes-21聚成一類，8D03～8D04與Mes-7聚成一類，因此8D03～8D04的種屬關系還需進一步驗證。

2.3 ISSR的統計分析

2.3.1 ISSR-PCR擴增

以遼寧省分布最多的Mes-6為研究對象，32份樣本進行擴增，11條引物共獲得56個位點，片段大小分布在300 bp～2 000 bp，其中具多態性的位點51個，占總位點數的91.07%。

2.3.2 遺傳多樣性分析

利用遺傳多樣性分析軟件POPGEN version，遼寧省野生羊肚菌遺傳多樣性分析見表5。

由表5可知，居群水平上，平均每個位點的有效等位基因數 （Ne） 為 1.211 6±0.082 2，Nei’s基因多樣性（H） 為0.120 1±0.046 6，各居群多樣性信息指數為0.106 6～0.287 0，平均指數為0.177 4±0.069 5。居群之間，遺傳多樣性有顯著性差異，其中P8遺傳多樣性水平最高，采樣點位于朝陽北票市速生楊人工林中。P10遺傳多樣性水平最低，采樣點位于朝陽喀左老爺廟地區。

表5 野生羊肚菌遺傳多樣性水平Tab.5 Genetic diversity of Morchella

2.3.3 遺傳多結構分析

利用Arlequin軟件分析遼寧野生羊肚菌居群的基因多樣性Nei’s結果表明，遼寧省Mes-6野生羊肚菌種居群遺傳有一定分化。6個居群總基因多樣度（Ht）為0.306 2±0.028 5，其中居群內多樣度（Hs） 為0.120 1±0.009 8，居群間基因多樣度為0.186 1，居群間遺傳分化系數（Gst）為0.607 9，表明在物種水平上，居群間存在60.79%的遺傳變異，而居群內存在39.21%的遺傳變異，居群間的遺傳分化大于居群內。基因流（Nm）為0.322 5，表明遼寧省野生羊肚菌在各地區存在非常有限的交流或短距離移動。

2.3.4 居群聚類分析

Nei’s遺傳一致度與遺傳距離見表6。

由表6可知，運用POPGEN version軟件分析獲得6個居群間的遺傳距離（D）和遺傳一致度（I），遺傳距離為0.084 6～0.492 1，遺傳一致度為0.611 4～0.918 9。

表6 Nei’s遺傳一致度與遺傳距離Tab.6 Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance

3 討論

羊肚菌資源種類豐富，營養和藥用建價值高，對羊肚菌種屬關系的鑒定是羊肚菌資源保育及其開發利用的基礎。傳統羊肚菌研究是基于羊肚菌形態學和生態學，包括子實體形態觀察和顯微結構觀察等。收集的53份遼寧省野生羊肚菌子實體，表面多凹坑，凹坑形狀不規則，棕黃色至深褐色；菌柄短且較細，乳白色，圓柱狀，表面光滑，符合羊肚菌的形態特征，可確定為羊肚菌，但很難對其進行準確的分類鑒定。野生羊肚菌在生長發育過程中，形態特征受環境條件影響較大，由于連續3年春季降雨比較少，全年干旱，采摘時地面上菌帽清晰可見，菌柄高度小于1 cm，菌帽采摘時已失水嚴重，子實體大小也比往年小[24]。

羊肚菌種屬豐富、物種多樣，采用單一的分子標記技術（如PCR-ITS，PCR-RAPD） 進行鑒定，會出現同物異名和同名異物現象[14]。對收集的53份樣品ITS rDNA進行測序分析，通過Morchella MLST數據庫比對，均屬于黃色羊肚菌支群，以Mes-10為外群，構建羊肚菌系統發育樹[28，30]；Mes-20、Mes-9和 12 份樣本 （8C01～8C03、8D05～8D08、6A01～6A02、6S01、 6S04～6S05，） 聚在一類，但無法精確鑒定這12份樣本種屬關系，可能導致同物異名現象發生。

多基因系譜一致性系統發育種識別法（GCPSR法），是通過多基因構建系統發育樹進行物質界定，因此也被稱為多基因聯合分析法。通過對ef1-α、LSU、rpb1核酸序列測序[7，20]，結合ITS序列，采用MP法，構建羊肚菌進化樹，獲得遼寧省羊肚菌遺傳多樣性圖譜。通過GCPSR法，將ITS法精確鑒定的12份樣本與Mes-20和Mes-9清晰分開。

在基于ITS序列的物種多樣性的基礎上，結合ef1-α、LSU、rpb1三個片段，聯合分析，更準確、全面地對遼寧省羊肚菌屬進行了分析，并界定到具體的物種并正確命名。53份羊肚菌樣本被鑒定為5種，即 Morchella sp.（Mes-6）、Morchella sp.（Mes-8）、Morchella sp.（Mes-9）、Morchella sp.（Mes-20）、Morchella sp.（Mes-21），其中， Mes-20 和Mes-21為遼寧省新記錄種。8X01～8X06、8C04～8C19、8C91、7S02～7S06、7C01～7C02、7C05～7C06、6F01～6F02、6S02 鑒定為 Mes-6，8B01～8B02鑒定為Mes-8，6S01、 6S04～6S05 鑒定為 Mes-9，8C01～8C03、 8D05～8D08、 6A01～6A02 鑒 定 為 Mes-20，8D01～8D04鑒定為Mes-21。在羊肚菌多基因序列模標數據庫Morchella MLST[28]中，有遼寧省2個采樣點的數據，丹東采樣點收集的羊肚菌鑒定為Mes-8，康平采樣點收集的羊肚菌鑒定為Mes-6。對遼寧省康平地區羊肚菌資源[26]收集鑒定后，確定康平存在2個羊肚菌種，即Mes-6和Mes-9。收集的53份樣本，鑒定為5個種，經比對，確定Mes-20和Mes-21為遼寧省新記錄種。該研究成果不僅豐富了遼寧省野生羊肚菌多樣性的菌種資源庫信息，還為野生羊肚菌的人工栽培及進一步開發利用提供科學依據。遼寧省羊肚菌物種多樣性豐富，還需加強羊肚菌資源分類研究。

4 結論

利用11條ISSR引物對Mes-6的6個居群進行分析，結果顯示，遼寧省羊肚菌在居群水平上的遺傳多樣性較低。雖然遼寧省東部山區、大凌河流域特有的地理特征、生境特征，為豐富遺傳資源提供了孕育場所，但近些年人們對羊肚菌認識越來越廣泛，人為濫采濫伐，造成了生態環境破壞和居群片段化，對遼寧省羊肚菌資源調查的準確性造成了一定的影響。因此，需加強野生羊肚菌資源的保護，進一步研究遼寧省羊肚菌種群進化活躍區域，探索遼寧省羊肚菌種群、居群間的演化過程。