地龍口服液對大鼠的亞慢性毒性試驗

房春林，黃 興，殷中瓊

（1.成都農業科技職業學院，四川成都 611130；2.四川農業大學，四川成都 611130）

地龍（又名蚯蚓）為鉅蚓科動物參環毛蚓PheretimaasPergilium（E．Perrier）、 通俗環毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉環毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環毛蚓Pheretima Pectinifera Michalsen的干燥體，氣腥，味咸，性寒，歸肝、脾、膀胱經，具有清熱平肝、定驚、消炎止痛、通絡、平喘、利尿等作用。常用于治療高熱神昏、狂躁、肺熱咳喘、尿少水腫[1～3]。現代醫學研究證明其具有鎮靜、抗驚厥、解熱、平喘、抗血栓、抗病毒等生物活性[4～6]。臨床上可用于治療癲癇、慢性支氣管炎、支氣管哮喘、微循環障礙等[7～8]。本研究的目的是在研究地龍口服液急性毒性的基礎上，進一步對其進行亞慢性毒性試驗研究，評價地龍口服液的安全性，為獸醫臨床用藥安全提供參考依據。

1 材料

1.1 試驗動物

4 周齡SD 大鼠80 只， 雌雄各半， 體重90 ～110 g。購于成都達碩實驗動物研究所，合格證號：SCXK（川）2013-24。

1.2 藥品

地龍口服液（含量：含原生藥量為10 g/ml），由成都乾坤動物藥業股份有限公司中試生產，生產批號：20200101。

1.3 主要試劑

血細胞計數配套試劑（稀釋液、溶血素、清洗液等），購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

血液生化指標配套試劑盒（質控血清、ALP、TP、ALB、ALT、AST 、BUN、TG、TH0、GLU 等）,購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

甲醛、氯化鈉、乙醇、肝素鈉等，購自成都化學試劑廠。

1.4 主要儀器

離心機：EPPendorf5804；邁瑞血細胞分析儀：深圳邁瑞生物醫學電子有限公司，BC-2800；邁瑞血液生化分析儀：深圳邁瑞生物醫學電子有限公司，BS-180；顯微鏡：奧林巴斯；切片機：徠卡（2016）；電子天平：賽多利斯。

2 方法

2.1 試驗分組

選用健康的SD 大鼠80 只（4 周齡，體重90 ～110 g），雌雄各半，隨機分為4 組，設高、中、低劑量組和對照組，每組20 只。

2.2 給藥劑量與給藥途徑

參照獸藥研究技術指導原則匯編中亞慢性試驗方法進行[9]，試驗組設高中低劑量組分別為3125 mg/kg、1042 mg/kg、313 mg/kg，空白對照組每天給予等劑量的生理鹽水。各給藥組均按每組動物的平均體重分別計算出每天的給藥量，灌胃針每天開水煮沸消毒，每天上午灌胃1 次，連續灌服30 d，自由采食飲水，停藥后觀察2 周。

2.3 臨床表現觀察

整個試驗期間，每日早晚觀察并記錄大鼠被毛、眼、粘膜改變和呼吸系統、神經系統、肢體活動、行為方式等變化發生的時間、程度和持續時間。對發現的死亡動物或瀕危動物進行及時剖檢。

2.4 體重和攝食量

每日測量1 次飼料和飲水消耗量，每周測體重1 次。

2.5 血液學檢查

給藥結束后每組剖殺10 只大鼠，雌雄各半。大鼠眼眶靜脈采血0.5 ml，注入真空肝素鈉抗凝管中，進行血液生理指標的測定，檢查指標包括血紅蛋白（HGB）、紅細胞（RBC）、血小板（PLT）、白細胞（WBC）及分類計數中性粒細胞（GRA）、淋巴細胞（LYM）和單核細胞（MID），嗜酸性粒細胞（EO），嗜堿性粒細胞(BASO)。

2.6 血液生化檢查

大鼠眼眶靜脈采血2.0 ml，放入潔凈離心管中，室溫下靜置析出血清，3500 r/min 離心10 min，收集血清進行血液生化指標的測定。檢查指標包括白蛋白(ALB)、總蛋白（TP）、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖（GLU）、甘油三酯（TG）和總膽固醇（CHO）。

2.7 臟器系數測定

對所有大鼠進行大體解剖，檢查體表、體腔的各開口處，顱、胸、腹腔及其內容物；心、肝、脾、肺、腎等臟器分離后盡快稱重，以防水分丟失。記錄臟器的絕對重量，并計算出相對重量（臟器系數=臟器重量/體重×100%）。

2.8 病理組織學檢查

試驗期間死亡的大鼠及試驗結束后處死的大鼠，在剖檢后取有關組織器官（心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、睪丸、卵巢）放入預冷的4 %多聚甲醛固定液內固定。按照石蠟切片常規制作程序制作組織切片，經蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察其病理組織學變化并采集圖片。

2.9 統計分析

數據使用SPSS19.0 軟件進行ANOVA 單因素方差分析，多個試驗組與對照組的比較用LSD 法，組間比較用Duncan 法，結果用（±s）表示。

3 結果與分析

3.1 臨床表現

整個試驗期間，各劑量組大鼠體重持續增長。大鼠精神正常，飲水采食活躍，眼黏膜、行為活動正常，未見被毛有脫落，分泌物和排泄物無異常，未出現中毒癥狀以及其它的毒性反應，實驗期間也沒有出現受試動物因藥物劑量而死亡的現象。

3.2 體重與攝食量比較

試驗期間，大鼠的采食、飲水等行為活動正常，藥物組與空白組比較飲水攝食量均無明顯差異。各給藥組與空白對照組大鼠體重變化比較差異不顯著（P ＞0.05）。表明地龍口服液對大鼠的生長無影響（見表1）。

表1 亞慢性毒性試驗中地龍口服液對大鼠體重的影響（±s，g）

表1 亞慢性毒性試驗中地龍口服液對大鼠體重的影響（±s，g）

性別組別試驗前第1周第2周第3周第4周雄空白對照組109.5±4.12159.75±11.9231.75±20.95261.5±26.59289±28.18低劑量組108.5±5160±5.03212±9.06252±11.94266.5±11.68中劑量組108±2.16153.25±6.7155±91.01242.25±17.17268.75±34.09高劑量組107±2.83154.75±6.08205.25±11.3255±9.52274.75±14.24雌空白對照組98.5±7.33134.75±10.08171.25±13.91197±16.81205.25±20.6低劑量組104.5±2.89141.25±5.44167.75±6.24199.75±7.27207.75±6.99中劑量組93.25±1.5105.75±62.13171.75±15.17199±18.89206.25±23.75高劑量組93.75±3.3131±2.16162±5.6186.25±9.46196±5.89

2.3 血液學指標比較

與對照組相比較，高劑量組嗜堿性細胞顯著高于空白組，其他血液學指標各組差異均不顯著(P＞0.05)。具體數據見表2。

表2 地龍口服液對大鼠血常規指標的影響（±s）

表2 地龍口服液對大鼠血常規指標的影響（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。

指標空白組低劑量組中劑量組高劑量組白細胞（WBC，109/L）10.79±3.310.16±3.719.37±3.8212.28±6.64紅細胞（RBC，1012/L）7.17±0.788.56±0.867.87±2.317.5±1.87血小板（PLT，109/L）888.43±622.9761.88±227.94824.11±307.06783.63±247.32淋巴細胞（LYM，109/L）7.17±1.337.14±2.36.66±2.597.63±3.56單核細胞（MID，109/L）0.49±0.20.39±0.140.37±0.160.5±0.32血紅蛋白（HGB，g/L）176.71±17.09192.25±25.53180.56±55.41167.5±44.22嗜酸性粒細胞（EO，109/L）0.48±0.20.38±0.140.36±0.160.49±0.32嗜堿性粒細胞（BASO，109/L）0.01±00.01±00.01±0.010.02±0.01*中性粒細胞（GRA，109/L）0.49±0.20.39±0.140.37±0.160.5±0.32

2.4 血清生化比較

大鼠的各項生化指標對比空白組均差異不顯著。可以認為地龍口服液對大鼠的較高劑量30 d喂養試驗低毒或無毒（見表3）。

表3 地龍口服液對大鼠血清生化指標的影響（±s）

表3 地龍口服液對大鼠血清生化指標的影響（±s）

項目空白組低劑量組中劑量組高劑量組ALB（g/L）40.9±2.7241.5±3.4649.91±33.1331.72±6.01 ALT（U/L）33.99±7.3440.19±8.7737.99±9.7238.25±6.92 AST（U/L）51.32±9.8747.88±5.1748.85±5.1445.17±3.97 BUN（mmol/L）0.7±0.720.94±0.971.08±0.820.95±0.78 GLU（mmol/L）3.95±0.653.91±0.374.73±1.214.82±0.87 CRE（μmol/L）82.92±108.4291.58±66.4387.08±26.9362.49±17.19 CHO（mmol/L）2.61±0.282.68±0.682.91±0.512.55±0.34 TG（mmol/L）0.52±0.190.74±0.20.59±0.310.46±0.24 TP（g/L）40.9±2.7241.5±3.4649.91±33.1331.72±6.01

2.5 臟器系數比較

試驗結束后剖殺各試驗大鼠，高劑量組肝臟表面部分區域有較淺的黃斑，可能與脂肪變性有關；其他各臟器未見明顯異常病變和損傷；與對照組相比，高劑量雄鼠的心臟系數升高；肝臟系數高劑量組雄鼠升高，所有給藥組的雌鼠降低，其他各劑量組臟器系數均差異不顯著(P ＞0.05)。結果見表4。

表4 地龍口服液對大鼠主要臟器系數的影響（±s）

表4 地龍口服液對大鼠主要臟器系數的影響（±s）

注：表示與對照組比較，*P ＜0.05，*P ＜0.01。

組別心（g/100 g）肝（g/100 g）脾（g/100 g）肺（g/100 g）腎（g/100 g）胃腸（g/100 g）卵巢/睪丸（g/100 g）雄空白組0.33±0.042.64±0.160.21±0.030.49±0.020.72±0.025.13±0.331.23±0.1低劑量組0.35±0.032.59±0.320.18±0.020.46±0.040.68±0.035.13±0.241.05±0.17中劑量組0.37±0.12.93±0.720.19±0.050.58±0.180.75±0.175.28±1.611.29±0.26高劑量組0.52±0.17*3.53±0.41*0.21±0.030.55±0.10.72±0.16.26±0.911.32±0.2空白組0.41±0.043.3±0.120.26±0.010.54±0.030.66±0.057.19±0.330.07±0.02低劑量組0.29±0.172.91±0.24*0.21±0.030.58±0.040.67±0.086.78±0.660.09±0.01中劑量組0.37±0.032.9±0.19**0.25±0.050.69±0.08*0.69±0.07*6.35±0.50.06±0.01高劑量組0.36±0.032.9±0.19**0.23±0.010.56±0.070.73±0.09**5.99±0.450.09±0.01雌

2.6 組織病理學比較

對第30 天采樣的各劑量試驗組和對照組大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃腸、睪丸、卵巢進行病理組織學檢查。結果表明：高劑量組的心肌細胞間有輕微的淤血（見圖1），肝索邊緣的細胞部分發生脂肪變性和水泡變性，細胞腫脹變圓（見圖2）。試驗組的低、中、高劑量組大鼠肺泡壁有不同程度的增厚，肺泡上皮細胞增生，間隙增厚肺泡腔變窄，毛細血管有輕微的充血，腔內干凈無滲出（見圖3），腎小球毛細血管均發生了輕度的充血和溶血；低劑量組腎小管上皮細胞有輕微腫脹變圓，腎小管管腔變窄，間質部分區域發生了溶血（見圖4）。各試驗組與對照組其它臟器病理組織結構均正常。

圖1 對照組（A）：大鼠心臟具有清晰完整的結構，心肌細胞呈條索狀規則排列（HE 400 ×）；高劑量組（B）：心肌細胞間有輕微的淤血（HE 400 ×）

圖2 對照組（A）：肝臟具有正常的肝小葉結構，在中央靜脈周圍肝細胞排列呈索狀結構，中央靜脈內有輕微的充血和溶血（HE 400 ×）；高劑量組（B）：肝索邊緣的細胞部分發生脂肪變性和水泡變性，細胞腫脹變圓（HE 400 ×）

圖3 對照組（A）：具有正常完整的肺泡結構，肺泡壁薄，由單層或多層細胞組成，肺泡腔內干凈無異物（HE 400 ×）；高、中、低劑量組（B）：肺泡壁有不同程度的增厚，肺泡上皮細胞增生，間隙增厚肺泡腔變窄，毛細血管有輕微的充血，腔內干凈無滲出（HE 400 ×）

圖4 對照組（A）：具有正常的組織結構，皮質和髓質結構清晰完整（HE 400 ×）；高、中、低劑量組（B）：腎小球毛細血管均發生了輕度的充血和溶血，腎小管上皮細胞有輕微腫脹變圓，腎小管管腔變窄，間質部分區域發生了溶血（HE 400 ×）

3 討論與結論

3.1 血常規檢測

血常規檢查是臨床上最基礎、最重要的化驗檢查之一，可作為臨床診治疾病的重要依據，判斷外源化學物對機體的感染損傷[10～11]。本研究結果表明，地龍口服液30 d 亞慢性毒性試驗的高劑量組嗜堿性粒細胞數量增加。通常情況下，嗜堿性粒細胞在血液中含量太低，略微的升高或降低一般不具有臨床意義。且在本實驗中，其他指標，如淋巴細胞、單核細胞、白細胞的差異均不顯著，因此認為地龍口服液對大鼠血常規各指標無影響。表明地龍口服液對大鼠血液系統、骨髓造血功能無影響。

3.2 血液生化檢測

血液學指標是反應機體健康狀況的主要指標，也是疾病診斷和檢測的指標之一。丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶和尿素氮是反映肝、腎功能的主要指標[12]。血清中尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）的含量高低與腎功能密切相關，當腎臟受損時，可導致腎小球濾過能力下降，使BUN 和CRE 含量升高[13]。血糖、總膽固醇和甘油三酯作為重要的生化指標，3 個指標均與肝臟有關[14]。當肝臟發生炎癥、壞死、中毒等損害及膽道疾病時，血糖、總膽固醇和甘油三酯將會出現變化[12]。亞慢性毒性實驗結果表明，空白組與藥物組的各項生化指標均無顯著性差異，因此認為地龍口服液對大鼠的較高劑量30 d 喂養試驗低毒或無毒。

3.3 病理組織學變化

對各劑量組大鼠內臟器官進行病理組織學觀察結果顯示：地龍口服液造成了肝臟和腎臟輕微淤血，高劑量組可能會導致肝細胞部分脂肪變性和水泡變性；藥物組的肺泡壁均有不同程度地增厚，但是14 d 后再次觀察，發現這些病理變化都能夠得到恢復，表明這些損傷是可逆的，證明了地龍口服液的安全性。

4 結論

地龍口服液的高、中、低劑量組大鼠連續30 d灌胃給藥后未出現明顯的毒性反應。試驗組大鼠采食、飲水和體重增長均正常。給藥后30 d 所測得的大鼠血液學指標、血液生化指標與正常對照組比較，個別有一定的變化。各臟器組織病理學檢查結果表明其可導致肝臟和肺臟發生可逆性的輕微變性變化，高劑量組可能會導致肝細胞的部分脂肪變性和水泡變性，無實質性變化。綜上所述，對大鼠給予地龍口服液灌胃毒性小，長期服用安全，無明顯的毒副作用，在3125 mg/kg 及其以下的劑量不會對動物機體產生明顯的毒性反應。