ESAT?6及CFP?10刺激顆粒酶B在兒童結核診斷中的價值

孫娜 姚聰 沈芯 王軍 袁純輝 向贇

1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院（武漢430016）；2湖北中醫藥大學（武漢430065）

結核病（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種高度傳染性的慢性疾病，嚴重危害兒童健康。2018年全球新發現的結核病兒童約112 萬例，死亡兒童高達20 萬［1］。兒童自身免疫力弱，感染MTB 后容易發展成活動性結核，但因臨床表現不典型和診斷方法自身的局限性，很容易造成漏診、誤診。

MTB 為胞內寄生菌，進入人體后，機體免疫系統以白細胞分化抗原CD4+T 和CD8+T 淋巴細胞介導的細胞免疫為主要應答模式［2］。在小鼠感染模型中，CD8+T 細胞對于維持結核潛伏感染狀態至關重要［3］。顆粒酶B（granzyme B，GrB）是發揮細胞毒作用的主要效應分子，能夠迅速引起靶細胞DNA 的斷裂，導致細胞凋亡［4-5］。OUNI 等［6］報道MTB 分泌抗原Rv0140 誘導的GrB 能夠區分ATB和LTBI，并且淋巴結結核的發生與CD4+T 和CD8+T表達GrB 減少有關。相比于IFN?γ主要由CD4+T 細胞分泌，GrB 可由CD8+T 和CD4+T 共同分泌，對診斷結核可能具有更高的敏感度［7-8］。本研究通過檢測6 kD 早期分泌靶向抗原（ESAT?6）和10 kD 培養濾過蛋白（CFP?10）刺激外周血單個核細胞（pe?ripheral blood mononuclear cells，PBMCs）后GrB 水平，評估其作為兒童結核診斷生物標志物的潛力。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器AIM?V 細胞培養液（天津灝洋華科生物科技有限公司）；ESAT?6/CFP?10 抗原（英國Oxford Immunotec 公司）；顆粒酶B 預包被ELISA試劑盒（北京達科為生物技術有限工司）；淋巴細胞亞群檢測試劑盒、BV?510?anti?INF?γ、BV510?anti?Granzyme B、FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD 公司）；固定液、破膜劑（美國BioLegend 公司）；血細胞分析儀XS?1000i（日本Sysmex 公司）；酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

1.2 研究對象選取2019年1?8月武漢金銀潭醫院就診的結核病患者26 例作為活動性結核（active tuberculosis，ATB）組，包括19 例肺結核和7例肺外結核，其中男12例，女14例，年齡1 ～15歲，中位數6.5 歲；選取20 例武漢兒童醫院T?SPOT陽性、但無臨床相關癥狀及影像學證據的為結核潛伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）組，其中男14 例，女6 例，年齡9 個月～13 歲，中位數6 歲；選取有咳嗽、發熱或體重減少等疑似結核臨床癥狀，但無活動性結核病證據的患兒20 例，作為非結核病對照（Non?TB）組，其中男12 例，女8 例，年齡1 ～13 歲，中位數4 歲；另選取來本院體檢的健康兒童20 例，作為健康對照（HC）組，其中男8 例，女12 例，年齡2 ～18 歲，中位數6 歲。將ATB 和LTBI 組合并作為結核組，Non?TB 和HC 組合并作為對照組。活動性結核組為既往未接受過抗結核分枝桿菌治療的初治TB 患者。納入標準（滿足任意一項）：（1）涂片抗酸桿菌或分枝桿菌培養陽性；（2）病理活檢提示結核；（3）臨床表現和影像學表現符合結核性改變，且抗結核治療有效。實驗組兒童均排除HIV 感染和肝腎功能衰竭等疾病。本研究獲得武漢兒童醫院倫理委員會批準（2020R044?E01）。

1.3 單個核細胞分離外周血2～3 mL（肝素鋰抗凝管）按照密度梯度離心法分離單個核細胞，使用血細胞分析儀計數制備250 000/100 μL 的細胞工作液。在96 孔板中，每個樣本對應的3 個檢測孔均加入100 μL 細胞工作液和50 μL AIM?V 細胞培養液，然后分別加入50 μL ESAT?6、CFP?10 溶液或AIM?V 培養液。37 ℃，5%CO2孵育20 h，取上清至-80 ℃備用。

1.4 GrB檢測按照GrB預包被ELISA試劑盒說明書操作。將樣本按照1∶10稀釋，100 μL/孔，室溫孵育2 h。洗板后加入Biotinylated antibody 工作液，室溫1 h。顯色后使用酶標儀讀取450 nm處吸光度。

1.5 流式細胞術6 孔板中加入單個核細胞5 ×106/孔和CFP?10 溶液，37 ℃孵育24 h。使用淋巴細胞亞群檢測試劑盒對T 細胞進行表面標記染色（PerCP 抗CD45、FITC 抗CD3、APC 抗CD4、PE 抗CD8）。固定和破膜后加入BV?510?anti?INF?γ和BV?510?anti?Granzyme B。流式細胞儀檢測并用Flow Jo 軟件分析。

1.6 統計學方法統計學分析采用SPSS 20.0軟件進行，正態分布計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗、χ2檢驗進行，應用Medcalc 軟件分析實驗組ROC 曲線，并根據約登指數確定最佳cut?off 值，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESAT?6/CFP?10 刺激后GrB 水平ESAT?6/CFP?10 抗原未刺激孔總GrB 基線水平較高，且存在個體差異，因此結核特異性GrB 的計算方法：結核特異性GrB=總GrBESAT?6刺激/CFP?10刺激-GrB培養液對照。ESAT?6/CFP?10 刺激后，結核組總GrB、特異性GrB水平均明顯高于對照組（P＜0.001），見表1。對結果進行亞組分析，總GrB、特異性GrB 在ATB 組、LTBI 組、HC 組差異均有統計學意義（P＜0.05），而ESAT?6 刺激后總GrB 在ATB 與Non?TB組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、圖1。

表1 ESAT?6/CFP?10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平Tab.1 Levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10 ±s，%

表1 ESAT?6/CFP?10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平Tab.1 Levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10 ±s，%

注：***P ＜0.001，ATB 和LTBI 組合并作為結核組，Non?TB 和HC 組合并作為對照組

分組結核組對照組例數46 40總GrB ESAT?6 刺激***1 091.58±449.31 766.03±364.87 CFP?10 刺激***1 208.41±451.14 765.53±304.54未刺激768.49±262.05 753.96±262.22特異性GrB ESAT?6 刺激***323.09±219.11 12.07±114.34 CFP?10 刺激***439.92±245.99 11.58±111.02

2.2 GrB 對結核組的鑒別診斷效能以結核組和對照組作為分類變量進行ROC 曲線分析顯示，CFP?10 刺激后總GrB、ESAT?6 特異性GrB、CFP?10特異性GrB 的最佳臨界值分別為981.86、117.93、162.81 pg/mL 時，診斷結核組的敏感度為69.57%、86.96%、86.96%，特異度為82.5%、82.5%、90%，AUC為0.793、0.923、0.96，見圖2。對比顯示，CFP?10 特異性GrB對結核組和對照組的鑒別診斷效能最高。

表2 ESAT?6/CFP?10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平在各亞組間的差異Tab.2 Comparison of the levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10±s

表2 ESAT?6/CFP?10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平在各亞組間的差異Tab.2 Comparison of the levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10±s

總GrB特異性GrB ESAT?6CFP?10ESAT?6CFP?10 970.65±339.481 040.36±361.58211.72±134.57281.43±158.66 ATB LTBI HC Non?TB P 值（ATB vs.LTBI）P 值（ATB vs.HC）P 值（ATB vs.Non?TB）P 值（HC vs.Non?TB）1 248.79±510.56 713.66±360.76 818.39±352.09 0.036 0.02 0.154 0.371 1 426.86±451.16 721.79±294.29 809.27±300.70 0.003 0.003 0.012 0.370 467.87±217.7 22.42±110.99 1.71±113.83＜0.001＜0.001＜0.001 0.574 645.94±168.32 30.55±123.67-7.4±89.56＜0.001＜0.001＜0.001 0.285

2.3 GrB 對ATB 與LTBI 組的鑒別診斷效能以ATB 組和LTBI 組作為分類變量進行ROC 曲線分析顯示，CFP?10 刺激后總GrB、ESAT?6 特異性GrB、CFP?10 特異性GrB 的最佳臨界值分別為1 214.39、269.36、423.67 pg/mL 時，用來區分ATB與LTBI組的敏感度分別為70%、85%、90%，特異度為80.77%、76.92%、84.62%，AUC 為0.735、0.856、0.923，見圖3。對比顯示，CFP?10 特異性GrB 對ATB 和LTBI組的鑒別診斷效能最高。

2.4 不同方法對結核組的診斷效能比較CFP?10刺激后特異性GrB 的臨界值為162.81 pg/mL 時，與T?SPOT、抗酸染色、Xpert MTB/RIF 區分結核組的效能進行比較顯示，特異性GrB 對結核診斷的敏感度、陰性預測值和準確度均高于其余三種方法（P＜0.01），見表3。

表3 不同檢測方法對結核的診斷效能評估Tab.3 Comparison of TB diagnosis among different detection methods

2.5 流式檢測CD8+T、CD4+T 細胞IFN?γ和GrB的表達為進一步探究GrB 對結核診斷的潛在機制，通過流式細胞儀檢測CFP?10 刺激ATB 患者和健康對照（HC）外周血單個核細胞后CD4+T 和CD8+T 細胞分泌的GrB、IFN?γ水平。結果顯示ATB組表達GrB 的CD4+T［（38.90±11.96）%］、CD8+T［（36.82±8.99）%］細胞明顯高于HC組CD4+T［（7.36±3.67）%］、CD8+T［（8.29±3.58）%］，P＜0.001）；而ATB 組僅表達IFN?γ的CD4+T［（34.18±8.07）%］細胞顯著高于HC 組［（4.06 ± 2.44）%］，差異有統計學意義（P＜0.001），見圖4。以上結果表明GrB 可由CD4+T、CD8+T 細胞同時分泌，而IFN?γ主要由CD4+T 細胞分泌。

3 討論

兒童痰液標本采集困難，目前基于痰液標本的多種檢測手段在結核感染診斷中具有較低的效能，如痰涂片在活動性肺結核中的檢出率只有16.4%［9］。2017年，基于PBMCs的γ?干擾素釋放試驗（interferon gamma release assay，IGRA）被納入結核診斷標準（WS288?2017）。SOLLAI 等［10］人使用meta分析發現結核感染T 細胞斑點試驗（T?SPOT.TB）和QuantiFERON?TB Gold（QFT）這2 種IGRAs 對診斷兒童結核的特異度高于90%，但敏感度較低，為47%～81%。此外，2018年MYRIAM等報道IGRA在HIV 感染合并ATB 患兒中，診斷ATB 的敏感度只有29%［11-12］，這可能是由于IFN?γ主要由CD4+T細胞分泌所致。本研究發現CFP?10 特異性GrB 區分結核組和對照組敏感度高達86.96%，敏感度高于IGRAs。

圖1 ESAT?6/CFP?10 刺激后總GrB 和特異性GrB 的水平Fig.1 Levels of total and MTB?specific GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10

圖2 ESAT?6/CFP?10 刺激后GrB 區分結核組與對照組的ROC 曲線Fig.2 The ROC curves of GrB to discriminate patients with TB from control stimulated by ESAT?6/CFP?10

圖3 ESAT?6/CFP?10 刺激后GrB 區分ATB 組與LTBI 組的ROC 曲線Fig.3 The ROC curves of GrB to discriminate patients with ATB from LTBI stimulated by ESAT?6/CFP?10

圖4 ATB 患者和HC 對照外周血CD4+T 細胞、CD8+T 細胞在CFP?10 刺激前后IFN?γ和GrB 的表達水平Fig.4 Qualitative analysis of GrB and IFN?γ expression ex vivo in CD4+/CD8+T cells stimulated by CFP?10 from patients with ATB and HC

SARKAR 等［13］研究發現GrB 可以作為合并感染HIV 的結核病人的一個診斷標志物。在本研究中，結核抗原活化的CD4+T 和CD8+T 細胞均能分泌GrB，同時既往文獻證實NK 細胞也能分泌GrB［14］，這可能是GrB 對結核診斷敏感度優于IGRAs 的原因。QuantiFERON?TB Gold Plus（QFT?Plus）在QFT的基礎上添加了誘導CD8+T 細胞免疫應答的新抗原肽段以提高敏感度，但仍不能鑒別ATB 和LTBI［15］。COMELLA?DEL?BARRIO 等［16］報道INF?γ需聯合IP10、鐵蛋白和25?羥維生素D才具有鑒別兒童ATB與LTBI 的潛力。TOGUN 等［17］研究表明檢測QFT?GIT 實驗上清中的一些其他細胞因子（如IP?10、IL?5、IL?13）具有區分兒童LTBI 和ATB 的潛力。在本研究中，單獨GrB 就具有區分ATB 和LTBI 的潛能，這可能是由于CD8+T 細胞是控制結核潛伏感染狀態的關鍵細胞，GUGGINO 等［18］也證實CD8+T 分泌的顆粒酶A 可鑒別LTBI 和ATB。由上述可見，聯合檢測結核抗原特異性GrB 和IFN?γ可提高兒童結核診斷敏感度，并具有區分ATB和LTBI的潛能。

檢測發現各實驗組抗原未刺激孔總GrB 的基線水平較高，且存在個體差異，綜合分析提出結核特異性GrB 的概念。WANG 等［19］研究報道ESAT?6/CFP?10 抗原特異性TNF?α對ATB 的診斷效能顯著優于總TNF?α。本實驗結果顯示ESAT?6 刺激后ATB 組總GrB 在ATB 與Non?TB 組間無統計學差異，而CFP?10刺激組總GrB和特異性GrB對結核的診斷效能均優于ESAT?6 組。原因可能是ESAT?6蛋白可通過C 端6 個氨基酸與TLR2 或是β2 微球蛋白直接相互作用，激活TBK1 和IRF3 信號軸，從而抑制宿主巨噬細胞抗原呈遞和炎癥因子釋放等多種功能，而CFP?10 則不具有免疫抑制功能［20-22］。這兩種結核抗原對GrB 釋放的分子水平差異有待進一步研究證實。

結核特異性GrB 具有作為新型結核診斷生物標志物的潛能，對兒童活動性結核的鑒別診斷具有重要價值。但由于兒童初治和確診為活動性結核的標本收集困難，本實驗納入方法學評價的樣本例數不多，GrB 對結核的診斷效能仍需要擴大樣本量來進一步證實。