丹參藥材的磷脂-微乳電動色譜指紋圖譜研究

宋 靜，吳紅海，劉建芳

中藥丹參為唇形科多年生草本植物丹參的干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、涼血消腫、除煩清心等功效[1]。丹參及其相關制劑在臨床上常用于治療心絞痛、月經不調、心煩不眠、經閉痛經等[2]。丹參藥材主要產于河北、山東、河南、江蘇、四川、浙江等省，受各地氣候和生長環境的影響，導致其在質量和主要成分含量上存在很大的差異[3]，故加強其質量管理具有重要意義。丹參有效成分包括水溶性成分(丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、異阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等酚酸類化合物)和脂溶性成分(二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA等菲醌類化合物)，水溶性成分作用是治療腦血管疾病[4-5]，脂溶性成分隱丹參酮有抗血小板聚集活性作用[6]。目前對丹參質量監測，脂溶性成分以丹參酮ⅡA為代表，水溶性成分以丹酚酸B為代表[1]，這種通過測定單一成分或幾個指標成分的檢測方法對評價丹參藥材質量存在局限性，不足以全面評價藥材質量。微乳電動色譜(microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC)是一種以微乳液滴為分離介質的電泳分離技術，因其分離度高、適用范圍寬，廣泛用于藥品、食品及環境樣品的檢測[7-9]。本研究擬采用MEEKC分析技術對來源于3個不同產地9個不同批次的丹參藥材進行指紋圖譜分析，然后采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件對獲得的指紋圖譜進行相似度評價，為丹參藥材的質量監測和真偽辨別提供科學依據，并為控制丹參藥材內在質量的均一性和穩定性提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1儀器 Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀、DAD檢測器(美國Beckman公司)；彈性石英毛細管柱(河北永年光導纖維廠，60 cm×50 μm，ID，有效長度50 cm)；BP211D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ-3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EYELA OSB-2100旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；pH-3C型pH計(上海雷磁儀器廠)。

1.2試劑與樣品 注射級大豆磷脂(SP)購于上海太偉藥業股份有限公司；膽酸鈉(SC)、聚凝胺(PB)、葡聚糖硫酸鹽(DS)、十二烷基苯均購于美國Sigma公司；對照品：丹參素鈉、丹酚酸B均購于中國藥品生物制品檢定所；迷迭香酸購于中國食品藥品檢定研究院。正丁醇、正辛醇(分析純)購于天津市永大化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉(分析純)購于北京北化精細化學品有限責任公司；二甲基亞砜購于天津市標準科技有限公司；化合物苯甲酰胺、鄰甲苯胺、2-萘酚由河北醫科大學藥學院提供；甲醇(色譜純)購于天津市康科德科技有限公司；實驗用水為娃哈哈飲用純凈水。9批丹參藥材產地分別為河北、山西和山東(表1)，均經河北醫科大學藥學院生藥教研室研究人員鑒定為唇形科植物丹參的干燥根及根莖。

表1 9批丹參藥材樣品產地及批號

1.3電泳條件

1.3.1檢測條件：毛細管柱總長度60 cm(內徑50 μm，有效長度50 cm)，用20 kV恒壓分離，檢測波長208 nm，壓力進樣：0.8 psi，8 s，柱溫25℃。

1.3.2微乳流動相的制備：微乳處方構成為SP∶SC∶正丁醇∶辛醇∶20 mmol/L磷酸二氫鈉磷酸鹽緩沖液=2.0∶3.5∶6.0∶0.7∶87.8(pH=7.4)。稱取處方量的生物表面活性劑SP和SC于密封性容器內，用水相(20.0 mmol/L磷酸二氫鈉磷酸鹽緩沖液)溶解，依次加入助表面活性劑正丁醇、油相辛醇，搖晃均勻、超聲30 min，在室溫條件下靜置12 h以上至微乳溶液搖晃后仍可保持澄清，則表明穩定微乳體系形成，最后用飽和氫氧化鈉調pH值至7.4備用，用前用0.45 μm濾膜過濾[10]。

1.3.3毛細管預處理：①毛細管活化：首先用甲醇沖洗新管3 min，再依次用水0.5 min、0.1 mol/L鹽酸15 min、水0.5 min、1.0 mol/L氫氧化鈉15 min沖洗，靜置30 min。②毛細管涂層：先用5% PB水溶液沖洗20 min，靜置20 min后，再用3% DS水溶液沖洗20 min，靜置30 min，用水沖洗5 min即可使用[10]。

1.4溶液制備

1.4.1對照品溶液的制備：分別精密稱取丹參素鈉1.0 mg、迷迭香酸5.0 mg、丹酚酸B 5.1 mg置于容量瓶中，用甲醇溶解定容至5 ml，得到濃度分別為0.2 mg/ml的丹參素鈉、1.0 mg/ml的迷迭香酸、1.02 mg/ml的丹酚酸B對照品儲備液。

1.4.2供試品溶液的制備：稱取丹參藥材粉末(過60目篩)5.0 g于具塞錐形瓶中，加入75%的甲醇20 ml，超聲提取60 min，過濾得濾液；殘渣中再加入甲醇20 ml，超聲提取60 min，過濾得濾液。合并濾液，減壓濃縮，用甲醇定容于5 ml容量瓶中，得1.0 g/ml丹參提取液。取丹參提取液500 μl，加入到“1.3.2”項下制備的500 μl微乳流動相中，加入電滲流標記物二甲基亞砜6 μl、微乳標記物十二烷基苯4 μl搖勻作為供試品溶液。標準混合液制備：微乳流動相1 ml，加入苯甲酰胺甲醇溶液(30 mg/ml)6 μl、鄰甲苯胺甲醇溶液(100 mg/ml)6 μl、2-萘酚甲醇溶液(100 mg/ml)4 μl和電滲流標記物二甲基亞砜6 μl、微乳標記物十二烷基苯4 μl[10]。

1.4.3保留因子的測定與計算：采用“1.3.1”項下檢測條件測定，保留因子logk計算公式如下[11]：

tS、tEOF和tME分別代表待測物、二甲基亞砜和十二烷基苯的遷移時間。

1.5方法學考察

1.5.1溶質遷移時間和保留因子重現性：為減少遷移時間變化帶來的溶質logk測定誤差，以及保證測定的準確性，在每個樣品溶液中都加入二甲基亞砜和十二烷基苯[12]。以組成SP∶SC∶正丁醇∶辛醇∶20 mmol/L磷酸二氫鈉磷酸鹽緩沖液=2.0∶3.5∶6.0∶0.7∶87.8的微乳(pH=7.4)為MEEKC分離介質，用標準混合液進樣，考察動態涂層條件下溶質遷移時間的重復性，色譜圖見圖1。測定樣品前，先用標準混合液檢測涂層的穩定性，若化合物遷移時間的RSD在3.0%內，則表明涂層穩定。

圖1 標準混合液的典型色譜圖

1.5.2精密度試驗：取S1號樣品，按照“1.4.2”項下的方法制備供試品溶液，連續進樣5次，測定指紋圖譜，1號峰作為參照，計算各共有峰的相對遷移時間和相對峰面積，結果RSD均小于3.0%，表明供試品進樣精密度良好，符合指紋圖譜要求。

1.5.3穩定性試驗：取S1號樣品，按照“1.4.2”項下的方法制備供試品溶液，分別測定樣品在0、2、4、6、12、24 h的指紋圖譜，以1號峰為參照，計算各共有峰的相對遷移時間和相對峰面積，結果RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性較好。

1.5.4重復性試驗：取S1號樣品，按照“1.4.2”項下的方法制備供試品溶液6份，平行操作，測定指紋圖譜，以1號峰為參照，計算各共有峰的相對遷移時間和相對峰面積，結果RSD均小于3.0%，表明本實驗測定方法的重現性良好，符合指紋圖譜的要求。

以上結果表明指紋圖譜中各色譜峰的相對遷移時間和峰面積基本一致，相似度較高，符合指紋圖譜研究的要求。

2 結果

2.1指紋圖譜的建立 精密稱定不同批次(S1～S9)的丹參粉末，分別按照“1.4.2”項下的方法制備并進行測定。用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012A版)”分析，用S1號樣品圖譜作為參照圖譜，時間窗寬度設定為0.1，采用中位數法自動匹配生成丹參指紋圖譜共有模式(即對照圖譜，圖2)，丹參疊加圖譜見圖3。

圖2 丹參藥材磷脂-微乳電動色譜指紋圖譜

圖3 9批丹參樣品微乳電動色譜指紋圖譜共有模式 S1～S9分別表示9種不同批次丹參樣品

2.2指紋圖譜分析

2.2.1共有指紋峰：分析比較9批丹參樣品的MEEKC色譜圖，以丹參7個共有峰作為指紋圖譜的特征峰，通過相對保留因子(表2)及標準加入增高法，確認1號峰為迷迭香酸，4號峰為丹參素，5號峰為丹酚酸B。其中以1號峰迷迭香酸峰為參照峰，分別求出各共有峰與之相比的α值(保留因子logk之比)和各共有峰相對峰面積之比見表3。

表2 9批丹參樣品微乳電動色譜指紋圖譜中7個共有峰的相對保留因子α值

表3 9批丹參樣品微乳電動色譜指紋圖譜中7個共有峰的相對峰面積

2.2.2指紋圖譜聚類分析：經過比較分析，丹參藥材的磷脂-MEEKC指紋圖譜中比較明顯的共有峰有7個。根據表3中的相對峰面積比值，用統計學軟件SPSS 21.0采用hierarchical cluster analysis對9個不同批號的丹參樣品進行聚類分析，聚類方法為between groups linkage，以歐式距離作為樣品測度，得聚類分析圖，見圖4。當距離標尺為1時，樣品S1、S2、S7、S8，樣品S3、S9，樣品S4、S5與樣品S6各歸為一類；距離為2時樣品S3、S9與樣品S6歸為一類；距離為3時，樣品S1、S2、S7、S8與樣品S3、S6、S9歸為一類；距離為25時，所有樣品才歸為一類。

圖4 丹參藥材磷脂-微乳電動色譜指紋圖譜的聚類分析圖

2.2.3相似度評價：將測定的MEEKC數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012A版)”軟件，經多點校正取Mark峰，匹配色譜峰，生成對照圖譜，行各批次色譜峰差異性和整體性評價。相似度值：S1-0.995，S2-0.996，S3-0.995，S4-0.883，S5-0.999，S6-0.989，S7-0.995，S8-0.989，S9-0.994。除S4外，其余批次丹參樣品指紋譜相似度良好。

3 討論

3.1MEEKC MEEKC是在膠束電動毛細管色譜基礎上發展起來的一種電泳技術，由于微乳介質的高溶解性，更加拓寬了毛細管電動色譜法的分離范圍，可分離水溶性、脂溶性、帶電或不帶電物質。因MEEKC分離效率高、適用范圍廣和樣品消耗量少，在藥物分離中廣泛應用。經典的微乳體系常以十二烷基硫酸鈉為表面活性劑，使用未涂層石英毛細管在堿性條件下分離。本文將磷脂-MEEKC用于丹參藥材指紋圖譜的研究，與高效液相色譜法相比，具有溶劑耗費少、環保、成本低的特點。本研究首次將磷脂修飾的MEEKC技術引進到丹參藥材指紋圖譜研究中，以含生物類表面活性劑SP和SC制備的微乳作為分離介質，經離子動態涂層法在人體血液pH=7.4條件下分離成分，一是探索MEEKC用于指紋圖譜研究的可行性，二是利用磷脂微乳的特殊結構，模擬藥物在體內透膜過程[10]。

3.2保留因子及涂層方法考察 本研究采用PB、DS進行動態涂層，與未涂層的石英毛細管裸管相比，在檢測樣品時更穩定，重現性更好[12-13]。本研究在動態涂層條件下以同批次微乳為MEEKC分離相，測定標準混合液，考察溶質遷移時間重復性。結果連續測定3 d，3種化合物的遷移時間RSD在2.5%內。隨著進樣次數的增多和檢測時間的延長，遷移時間RSD變大，原因可能是樣品在毛細管內壁的吸附或離子涂層的損壞。為保證測定準確性，在測定樣品時，用標準混合溶液進行重復性檢測，如標準樣品的遷移時間出現較大偏差，則對毛細管沖洗處理；沖洗后無改善則需重新涂層毛細管。

3.3檢測波長的選擇 本研究采用二極管陣列檢測器對檢測波長進行考察并結合相關文獻報道[14-15]，根據藥物的紫外吸收特征，比較不同波長的色譜圖，發現208 nm波長處丹參藥材色譜圖中色譜峰較多，且電滲流和微乳液滴標記物及對照品均有較好吸收，因此確定208 nm為檢測波長。

3.4實驗結果分析 本研究測定出丹參藥材成分均為水溶性成分，而未定性出脂溶性成分。原因可能為丹參藥材中脂溶性成分含量較低[16]，電動色譜法雖分離效率高，但靈敏度較低，本研究方法的檢測限測不到脂溶性成分，與已報道的其他分離介質電動色譜檢測結果一致[15]。相似度實驗結果表明，除河北1個批次丹參藥材外，其余各產地不同批次丹參樣品指紋圖譜相似度較好(>0.989)。但不同產地間同一成分峰面積不同，此研究結果表明，不同產地藥材間同一成分含量存在差異。

本研究建立的丹參藥材磷脂-MEEKC指紋圖譜具有較好的精密度和重現性，能夠應用本研究的指紋圖譜技術對丹參藥材的質量進行全面評價，檢測出不同產地及不同批次藥材間的質量差異。