VEGF-D、P-gp及P15蛋白在腦膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性

向 斌，杜 軍，張維波，劉 盛

腦膠質(zhì)瘤是由神經(jīng)外胚葉衍化而來的膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的腫瘤，為顱內(nèi)腫瘤中常見的一種，發(fā)病率為36%～63%[1-2]。腦膠質(zhì)瘤惡化程度高，侵襲力強(qiáng)，臨床一般藥物治療無法透過血腦屏障，即使使用放療臨床效果也不明顯，手術(shù)治療難以完全清除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高[3]。因此，探索新的治療及早期診斷方法為目前研究熱點(diǎn)。既往認(rèn)為腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與后期發(fā)展有多種因素、步驟、基因變異參與。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞周期控制紊亂是導(dǎo)致其增生失控從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[4-5]。因此，本文分析血管內(nèi)皮生長因子-D(VEGF-D)、P-糖蛋白(P-gp)及P15蛋白在腦膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，旨在為腦膠質(zhì)瘤的臨床診斷、治療及預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年1月—2019年2月我院收治的經(jīng)手術(shù)后病理檢查確診為腦膠質(zhì)瘤患者69例的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料、病理資料完整；簽署相關(guān)知情同意書；不存在其他影響本研究的疾病；卡氏評分在70分以上；預(yù)計生存時間1年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：治療前存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；臨床資料不完整者；病理檢查前應(yīng)用放療、化療等治療者；存在免疫或血液系統(tǒng)疾病者。69例中男37例，女32例；年齡30～75(46.35±6.88)歲；膠質(zhì)瘤Kernohan分級：Ⅰ～Ⅱ級28例、Ⅲ～Ⅳ級41例；腫瘤直徑≥5 cm 38例，<5 cm 31例；分化程度：低分化25例，中高分化44例。

1.2方法

1.2.1VEGF-D、P-gp及P15蛋白檢測方法：VEGF-D、P-gp及P15蛋白檢測均使用免疫組織化學(xué)染色。單克隆即用型抗體和免疫組織化學(xué)超敏SP試劑盒(SP Kits)均購自福州邁新生物技術(shù)公司，所有標(biāo)本均使用10%福爾馬林液固定，常規(guī)HE染色切片，并為了防止脫玻片按試劑盒說明書操作，設(shè)置已知VEGF-D、P-gp及P15蛋白組織切片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液作為陰性對照。VEGF-D細(xì)胞質(zhì)呈黃棕色或褐色為陽性表達(dá)，P-gp細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，P15蛋白細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。按照陽性細(xì)胞多少判斷其陽性程度，隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野，計算1000個瘤細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞所占比例。無明顯顯色陽性細(xì)胞為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)>10%為陽性。另選取手術(shù)治療時切除的正常組織(距腫瘤灶邊緣3 cm，病理檢查證實無非典型增生及腫瘤細(xì)胞)作為對照。

1.2.2隨訪：所有患者給予手術(shù)后輔助放化療，在結(jié)束后每隔3個月進(jìn)行復(fù)查，根據(jù)其影像學(xué)檢查結(jié)果、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查結(jié)果等作為復(fù)查診斷指標(biāo)。從治療結(jié)束后1周起隨訪1年。

1.3觀察指標(biāo) 比較69例癌組織、正常組織及不同臨床病理特征患者VEGF-D、P-gp及P15蛋白表達(dá)情況，分析VEGF-D、P-gp及P15蛋白與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1不同組織中VEGF-D、P-gp及P15蛋白陽性表達(dá)情況 瘤組織中VEGF-D、P-gp陽性表達(dá)率明顯高于正常組織，P15蛋白陽性表達(dá)率低于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 69例腦膠質(zhì)瘤患者不同組織中VEGF-D、P-gp及P15蛋白陽性表達(dá)情況[例(%)]

2.2臨床病理特征與VEGF-D、P-gp及P15蛋白表達(dá)的關(guān)系 VEGF-D、P-gp及P15蛋白表達(dá)與腫瘤病理分級、分化程度有明顯相關(guān)性(P<0.05或P<0.01)，與性別、年齡、腫瘤直徑無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 69例腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征與VEGF-D、P-gp及P15蛋白表達(dá)的關(guān)系(例)

2.3影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后單因素分析 治療后對患者隨訪1年，根據(jù)預(yù)后情況分為預(yù)后良好50例(72.46%)，預(yù)后不良19例(27.54%)。年齡、腫瘤病理分級、腫瘤分化程度及VEGF-D、P-gp、P15蛋白表達(dá)情況為影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)因素(P<0.05或P<0.01)；性別、腫瘤直徑與患者預(yù)后不相關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素分析(例)

2.4影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后多因素分析 經(jīng)多因素分析可知，年齡>45歲、病理分級Ⅲ～Ⅳ級、VEGF-D陽性表達(dá)、P-gp陽性表達(dá)、P15蛋白陰性表達(dá)及分化程度低為影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

有研究表明，腫瘤的發(fā)展、浸潤、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等和腫瘤的血管生成有著密切的關(guān)系，腫瘤血管生成與各種調(diào)節(jié)因子密不可分[6-7]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作為淋巴細(xì)胞生長因子同時也屬于主要的調(diào)節(jié)因子[8]，腫瘤的血管生成是由其家族成員和受體之間的相互作用所致[9]。VEGF-D則是其家族中的一員，既往文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)采用fms樣酪氨酸激酶4(Flt-4)親和層析法將VEGF從人前列腺癌細(xì)胞中分化后，可激活淋巴管內(nèi)皮上的受體，提示其屬于一種特異性較高的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂元，對淋巴管、血管生成有刺激作用，在與受體VEGFR-2、3結(jié)合后可出現(xiàn)信號傳導(dǎo)[10]。除此之外大量研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF-D在肺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中均有較高表達(dá)[11-12]。VEGF作為重要的促腫瘤血管生成因子，也是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。Flt-4在早期的胚胎血管中發(fā)育，在發(fā)育后期僅出現(xiàn)在發(fā)育中的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中。VEGF-D則是淋巴生成的重要信號傳導(dǎo)通路。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-D在腦膠質(zhì)瘤瘤組織中表達(dá)明顯高于正常組織，在不同病理分級、不同分化程度患者中表達(dá)有差異，結(jié)合既往文獻(xiàn)提示其在腦膠質(zhì)瘤病變、發(fā)展中存在重要的作用[13]。

P15蛋白定位于人染色體9p21區(qū)上，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，該區(qū)基因有著較高的丟失率。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤中存在P15基因缺失情況[14]。孫飛等[15]對腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，患者P15基因存在明顯缺陷。P15、P16基因缺失則在惡性程度高的腦膠質(zhì)瘤中多見。P15基因可與CDK4/CDK6結(jié)合，抑制該酶活性，阻止細(xì)胞進(jìn)展至G1期，在其缺少后抑制作用降低，癌基因中cyclinD就會占據(jù)優(yōu)勢與CDK4/CDK6結(jié)合，過度刺激細(xì)胞分裂增殖最終導(dǎo)致癌變。本研究正常組織中P15蛋白表達(dá)明顯高于癌組織，與既往文獻(xiàn)結(jié)果相符[16-17]。

在臨床腫瘤治療中，腫瘤細(xì)胞對于化學(xué)藥物的敏感性是影響手術(shù)治療效果的主要因素，術(shù)后復(fù)發(fā)概率高和腫瘤對化療藥物耐受性增加有關(guān)[18]。既往認(rèn)為腫瘤治療中的獲得性多藥耐藥是由抗癌藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生。有研究通過比較化療前后患者P-gp的表達(dá)情況，了解到化療組P-gp陽性表達(dá)增加，且認(rèn)為其是獲得性或原發(fā)性的[19]。徐凡等[20]對未經(jīng)化療的原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，在其惡變過程中發(fā)現(xiàn)P53、ras、MDR1等癌基因被激活現(xiàn)象，且MDR1 mRNA的異常活化導(dǎo)致P-gp的表達(dá)增加，出現(xiàn)此類原發(fā)性耐藥機(jī)制是導(dǎo)致患者首次化療失敗的重要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常組織中P-gp并不表達(dá)，與既往文獻(xiàn)研究結(jié)果相符[21]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-D、P-gp及P15蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與其腫瘤病理分級、分化程度有明顯相關(guān)性，且VEGF-D陽性表達(dá)、P-gp陽性表達(dá)、P15蛋白陰性表達(dá)為影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素。結(jié)合既往文獻(xiàn)分析，VEGF-D、P-gp及P15蛋白在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展中存在著重要的作用，說明VEGF-D陽性表達(dá)、P-gp陽性表達(dá)、P15蛋白陰性表達(dá)者病情較嚴(yán)重，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后差[22]。

綜上所述，VEGF-D、P-gp在腦膠質(zhì)瘤患者中表達(dá)增加，P15蛋白表達(dá)降低，三者表達(dá)情況變化可為患者治療方案制定、預(yù)后評估提供重要的參考。