輔助生殖技術對子代胎盤組織中HSP70、NF-κB表達的影響及臨床意義

王晶晶，陳書強，董 杰，邸 曼，王曉紅

體外受精和胚胎移植輔助生殖技術(assisted reproductive technology, ART)是通過對配子及早期胚胎進行體外操作，以達到輔助不孕不育夫婦獲得妊娠的一系列技術[1]。然而，其安全性也引起生殖醫學專家的極大關注。研究顯示，與自然妊娠相比，ART子代出現早產、低出生體質量兒、出生缺陷等不良妊娠結局的風險顯著增加[2]。胎盤作為孕期特有器官，不僅是母胎營養轉運的紐帶，還在維持正常妊娠過程中發揮重要的生理作用[3]。多項研究表明，ART子代胎盤出現結構和功能異常，與胎兒生長受限等密切相關[4-6]。熱休克蛋白70(HSP70)是熱休克蛋白家族中最保守的一種細胞內分子伴侶，可以參與蛋白質的折疊、促進蛋白質泛素化和蛋白酶降解，在保護細胞免受各種外界應激方面發揮著關鍵作用[7-9]。核轉錄因子-κB(NF-κB)是1986年首次發現的一種關鍵性轉錄因子，幾乎存在于所有類型細胞的胞質中，對免疫細胞活化、應激反應、細胞凋亡等具有調節作用[10-11]。本研究擬采用實時逆轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應及免疫印跡法檢測ART和自然妊娠子代胎盤中HSP70與NF-κB的表達情況，并探討二者變化與ART不良妊娠結局發生風險增加的相關機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月—2019年6月在我院產科分娩的ART子代(ART組)和同期自然妊娠分娩的子代(對照組)作為研究對象。ART組納入標準：產婦年齡<35周歲，單胎妊娠,新生兒既往產檢正常且無出生缺陷,父母雙方染色體正常；排除標準：產婦孕前合并嚴重的內外科并發癥(如嚴重的高血壓病、糖尿病、甲狀腺疾病等),行胚胎冷凍移植者,行體外受精或接受胚胎植入前遺傳學診斷者。對照組為自然妊娠分娩的子代，納入標準與ART組相同，排除孕前合并嚴重內外科并發癥者。2組進行年齡、孕周、產前體質量指數(BMI)配對，以消除偏移，最終共納入ART組46例(體外受精-胚胎移植41例、卵胞漿內單精子注射5例)，對照組65例。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2研究方法

1.2.1標本采集：胎盤娩出后，2組各選取20例胎盤，立刻稱重，并剪取臍帶附著部位的胎盤小葉組織2 cm×2 cm×2 cm，去除母體蛻膜后將胎盤絨毛置于4℃預冷0.9%氯化鈉注射液中，漂洗多次至無血跡，分裝到冷凍管后立刻置于液氮中凍存1 h，最后轉移至-80℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2.2實時逆轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應檢測mRNA表達水平：將剪碎的胎盤組織加液氮研磨成粉末狀，用Trizol法抽提總RNA，用分光光度法進行定量，用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，采用SYBR Green試劑盒行實時逆轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應實驗，用2-ΔΔCt法分析數據。引物由上海生工公司設計并合成，見表1。

表1 實時逆轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應檢測胎盤組織mRNA表達引物設計

1.2.3免疫印跡法檢測蛋白表達水平：用RIPA裂解液提取2份胎盤組織蛋白后，BCA法測定蛋白濃度，用SDS Loading Buffer變性，處理好的樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后轉至聚偏二氟乙烯膜，牛血白蛋白溶液于4℃封閉過夜，洗滌后于37℃加入一抗孵育1 h，洗滌，37℃加入二抗孵育30 min，洗滌后顯影。一抗和二抗均購自英國Abcam公司。

1.3觀察指標 ①孕產婦基本情況：孕婦年齡、孕周、產前BMI及剖宮產比例；②孕產婦妊娠并發癥：妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、前置胎盤(中央性/部分性/邊緣性前置胎盤)、羊水異常(羊水過多/過少)、胎膜早破；③新生兒基本情況：新生兒出生體質量，胎盤重量，胎盤效率[新生兒出生體質量(g)/胎盤重量(g)]，早產(胎齡28～37周分娩的新生兒)，低出生體質量(新生兒出生體質量<2500 g)。④檢測2組胎盤HSP70、NF-κB mRNA及蛋白表達情況,并分析其相關性。

2 結果

2.12組產婦基本情況比較 ART組產婦年齡(26.54±4.85)歲，孕周(38.78±2.44)周，產前BMI(26.17±3.74)kg/m2，剖宮產比例為54.35%(25/46)；對照組產婦年齡(26.12±4.27)歲，孕周(38.88±2.17)周，產前BMI(25.89±3.65)kg/m2，剖宮產比例為43.08%(28/65)。2組產婦年齡、孕周、產前BMI和剖宮產比例等基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.22組產婦妊娠并發癥比較 與對照組相比，ART組產婦妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、羊水異常發生率均顯著升高(P<0.01)，前置胎盤和胎膜早破發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組產婦妊娠并發癥比較[例(%)]

2.32組新生兒基本情況比較 與對照組新生兒相比，ART組新生兒胎盤重量和早產、低出生體質量比率顯著升高(P<0.05)，新生兒重量和胎盤效率有降低趨勢但差異并無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組新生兒基本情況比較

2.42組胎盤組織中HSP70、NF-κB mRNA表達比較 ART組胎盤組織中HSP70、NF-κB mRNA表達量分別為(2.05±0.92)和(3.11±1.16)，對照組表達量分別為(0.76±0.35)和(1.18±0.65)，ART組胎盤組織中HSP70、NF-κB mRNA表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 2組胎盤組織中HSP70、NF-κB mRNA表達比較 ART組為采用輔助生殖技術妊娠，對照組為自然妊娠；HSP70為熱休克蛋白70，NF-κB為核轉錄因子-κB，ART為輔助生殖技術；與對照組比較，aP<0.05

2.52組胎盤組織中HSP70、NF-κB蛋白表達比較 ART組胎盤組織中HSP70、NF-κB蛋白表達量分別為(2.63±1.05)和(5.36±1.56)，對照組表達量分別為(1.72±0.86)和(2.45±0.89)，ART組胎盤組織中HSP70、NF-κB蛋白表達量均高于對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2 2組胎盤組織中HSP70、NF-κB蛋白表達比較 A為胎盤組織HSP70、NF-κB蛋白印跡條帶，B為胎盤組織HSP70、NF-κB蛋白印跡灰度分析結果；ART組為采用輔助生殖技術妊娠，對照組為自然妊娠；HSP70為熱休克蛋白70，NF-κB為核轉錄因子-κB，β-actin為內參基因；與對照組比較，aP<0.05

2.6胎盤組織中HSP70、NF-κB表達相關性分析 Pearson相關分析結果顯示：胎盤組織中HSP70與NF-κB表達呈正相關(r=0.865,P<0.05)。見圖3。

圖3 胎盤組織中HSP70、NF-κB表達相關性分析 HSP70為熱休克蛋白70，NF-κB為核轉錄因子-κB

3 討論

ART是指在體外對配子及早期胚胎進行的使不孕不育夫婦獲得妊娠的一系列操作，但其引發的醫源性應激可能致妊娠期并發癥及子代健康風險增加[2,12]，具體機制尚未闡明。胎盤由囊胚的滋養外胚層發育而來，是孕期特有器官，其不僅是母胎間營養物質轉移的紐帶，同時還具有促進新陳代謝、保護內分泌等功能[13]。本研究發現，ART助孕的孕產婦妊娠期并發癥發病率顯著升高，同時ART子代早產、低出生體質量的發生風險顯著增加，這可能與胎盤的結構和功能異常相關。

臨床研究顯示，特定的應激環境(病理或生理刺激)下，細胞內HSP70將通過細胞壞死和替代途徑分泌到細胞外，細胞外HSP70可以發揮趨化因子功能,誘導腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6等炎癥細胞因子分泌，促進誘導型一氧化氮合酶的表達和NF-κB發生核移位，進而促進更多炎癥細胞因子的釋放[14]。研究證實，過度的外源性或內源性應激會導致HSP70水平升高，通過NF-κB信號通路影響精子形成、卵巢早衰和先兆子癇、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、早產等妊娠并發癥發生[15-17]。

有研究發現，自然流產患者蛻膜組織中細胞凋亡率、HSP70表達水平均顯著高于自然流產患者，推測過度表達的HSP70可能誘導細胞凋亡，從而引起自然流產[8]。也有研究發現，妊娠期糖尿病孕婦的血清及胎盤組織中HSP70和NF-κB p65呈高表達狀態，引起胎盤結構和功能的變化并協同促進妊娠期糖尿病的發生[16-17]。還有研究發現，胎盤組織中HSP70 和NF-κB過度表達，可能與子癇前期的發生、發展有關[18]。本研究發現，ART子代胎盤組織中HSP70與NF-κB mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，且呈正相關。表明在宮內炎癥和氧化應激狀態下，二者協同作用維持正常妊娠，但是其過度的高表達可能與ART不良妊娠結局相關。

綜上，ART可導致子代胎盤組織過度生長，且胎盤組織中HSP70和NF-κB表達水平顯著升高，這可能與ART助孕的孕產婦更易發生妊娠期并發癥且ART助孕新生兒不良結局發生風險增加有關，但是具體機制尚不清楚。同時，本研究仍存在一些不足之處，如納入樣本量較少且未行亞組分析，后期仍需開展大樣本綜合性研究。